Aus dem Institut für Experimentelle
xperimentelle und Klinische
linische Pharmakologie und Toxikologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. Markus Schwaninger
Der Einfluss
luss des Orexinsystems auf die leptinregulierte
eptinregulierte
Genexpression hypothalamischer Neuropeptide bei
murinen mHypoA-2/23-Neuronen
mHypoA
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
-Aus der Sektion Medizin-
vorgelegt von
Martin Borlich
aus Magdeburg
Lübeck 2014
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. rer. nat. Olaf Jöhren
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. med. Diether Ludwig
Tag der mündlichen Prüfung:
05.06.2015
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 05.06.2015
-Promotionskommission der Sektion Medizin-
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ................................................................................................................. 1
1.1 Überblick über die Regulation der Nahrungsaufnahme und des
Energiestoffwechsels ........................................................................................ 2
1.2 Leptin und der Energiehaushalt ........................................................................ 4
1.3 Die Rolle der Orexine für die Ernährung und Energiebilanz .............................. 6
1.4 Interaktionen zwischen Leptin- und Orexinsystem ...........................................10
1.5 Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................10
2.
Material und Methoden ...........................................................................................13
2.1 Material ............................................................................................................13
2.2 Methoden .........................................................................................................13
2.2.1
Zellkultur ...........................................................................................13
2.2.2
Zellkultivierung für Versuche .............................................................14
2.2.3
RNA-Extraktion .................................................................................14
2.2.4
RNA-Quantifizierung mit RiboGreen® ................................................15
2.2.5
Reverse Transkription (cDNA-Synthese) ...........................................16
2.2.6
Quantitative Echtzeit-PCR (q-PCR)...................................................17
2.2.7
Agarose-Gelelektrophorese ..............................................................20
2.2.8
Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ...............................21
2.2.9
Untersuchung der mRNA-Stabilität ...................................................21
2.2.10
Immunhistochemie ............................................................................22
2.2.11
Western Blot .....................................................................................23
2.2.12
Statistische Methoden .......................................................................24
I
Inhaltsverzeichnis
3.
Ergebnisse..............................................................................................................25
3.1 Funktionelle Charakterisierung hypothalamischer mHypoA-2/23-Neurone
und deren Etablierung als Modellsystem ..........................................................25
3.2 Beeinflussung der leptinregulierten Genexpression hypothalamischer
Neuropeptide durch Orexine ............................................................................30
3.3 Einfluss von Orexinen und Leptin auf die Genexpression der
Orexinrezeptoren .............................................................................................38
3.4 Die posttranskriptionelle Modifikation der mRNA von NPY, AgRP
und AROM .......................................................................................................40
3.5 Untersuchung intrazellulärer Signalkaskaden ..................................................42
4.
3.5.1
Die Beeinflussung der intrazellulären Ca2+-Konzentration .................42
3.5.2
Die Aktivierung der ERK 1/2 (p44/42 MAPK) .....................................45
3.5.3
Die Aktivierung der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-2
und deren Einfluss auf ERK 1/2 (p44/42 MAPK) ...............................46
3.5.4
Die Regulation des Transkriptionsfaktors STAT3 ...............................49
Diskussion ..............................................................................................................51
4.1 Charakterisierung und Etablierung einer neuen Zelllinie: murine,
hypothalamische mHypoA-2/23-Neurone .........................................................51
4.2 Interaktion von Orexinen und Leptin und deren Einfluss auf die
Genexpression und Signaltransduktion ............................................................52
4.3 Diskussion der Limitationen dieser Studie und Ausblick ...................................65
5.
Zusammenfassung .................................................................................................66
6.
Literaturverzeichnis .................................................................................................68
7.
Anhang ...................................................................................................................83
8.
Danksagung ...........................................................................................................91
9.
Lebenslauf ..............................................................................................................92
II
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Übersicht über einige an der Steuerung des Appetits beteiligten
Signalwege und Hirnregionen .................................................................... 2
Abbildung 2: Signaltransduktion des aktivierten Leptinrezeptors..................................... 5
Abbildung 3: Das Orexinsystem als Schnittstelle zwischen mehreren
regulatorischen Systemen .......................................................................... 8
Abbildung 4: Übersicht über Möglichkeiten molekularer Interaktion der Signaltransduktion nach ObRb-, OX1- und des OX2-Rezeptorstimulation. ...........12
Abbildung 5: Morphologie der mHypoA-2/23-Neurone ...................................................13
Abbildung 6: Darstellung der für die PCR verwendeten Primersequenzen.....................18
Abbildung 7: Charakterisierung der hypothalamischen, neuronalen mHypoA-2/23Zelllinie mittels q-PCR ...............................................................................26
Abbildung 8: Vergleich der basalen Genexpression mit anderen hypothalamischen
Neuronen ..................................................................................................27
Abbildung 9: Agarosegelelektrophorese der mittels q-PCR amplifizierten cDNAFragmente. ...............................................................................................28
Abbildung 10: Schmelzkurvenanalyse amplifizierter cDNA von TH (A) und SF-1 (B) .......29
Abbildung 11: Schmelzkurvenanalyse amplifizierter cDNA-Fragmente (A) und
murines MCH-Gen (B). .............................................................................29
Abbildung 12: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von NPY
nach verschiedenen Behandlungszeiträumen ...........................................33
Abbildung 13: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von AgRP
nach verschiedenen Behandlungszeiträumen ...........................................34
Abbildung 14: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von POMC
nach verschiedenen Behandlungszeiträumen ...........................................35
Abbildung 15: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von CRH
nach verschiedenen Behandlungszeiträumen ...........................................36
Abbildung 16: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression des AROM
nach verschiedenen Behandlungszeiträumen ...........................................37
Abbildung 17: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression des OX1- (A)
und des OX2-Rezeptors (B) nach verschiedenen
Behandlungszeiträumen............................................................................39
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 18: mRNA-Stabilität von AgRP, NPY und AROM in mHypoA-2/23Neuronen unter Hemmung der Transkription mit Actinomycin D
und Behandlung mit Orexinen und Leptin .................................................41
Abbildung 19: Veränderungen intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen durch Orexine
und Leptin in mHypoA-2/23-(A) und NCI-H295R-Zellen (B) ......................43
Abbildung 20: Dosiswirkungskurven für Orexine, Leptin und deren Kombinationen .........44
Abbildung 21: Regulation von ERK 1/2 in mHypoA-2/23-Zellen durch Orexine
und Leptin .................................................................................................45
Abbildung 22: Phosphorylierung von SHP-2 an Position Tyr-542 durch Orexin A,
Orexin B und Leptin in mHypoA-2/23-Zellen .............................................46
Abbildung 23: Phosphorylierung von SHP-2 an Position Tyr-580 durch Orexin A,
Orexin B und Leptin in mHypoA-2/23-Zellen .............................................47
Abbildung 24: Abhängigkeit der ERK-1/2-Phosphorylierung von Orexin- und
Leptinstimulation unter Inhibition von SHP-2 in mHypoA-2/23-Neuronen ..48
Abbildung 25: Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors STAT3 durch Leptin
(100 nM), Orexin A (1 µM), Orexin B (1 µM) und deren Kombinationen.....49
Abbildung 26: Versuchsmodell potentieller synergistischer Signaltransduktion zur
Regulation der NPY-Genexpression in mHypoA-2/23-Neuronen. ..............53
Abbildung 27: Expressionsverhältnis von OX1R zu OX2R in hypothalamischen
Kerngebieten.............................................................................................63
IV
1.
Einleitung
Aus evolutionärer Sicht erfordert die kontinuierliche Energieversorgung des Organismus
eine stetige Kontrolle von Nährstoffaufnahme und -abgabe. Gewährleistet durch ein
komplexes System von Kontrollmechanismen und der Fähigkeit, Energie in Form
organischer Verbindungen zu speichern, sichert der menschliche Organismus unter
verschiedenen Lebensbedingungen seinen eigenen Fortbestand (Speakman, 2007). Das
in modernen Gesellschaften durch ubiquitäre Verfügbarkeit kalorienreicher Nahrungsmittel
bedingte Missverhältnis zwischen zu hoher Energieaufnahme und deren Speicherung
sowie reduziertem Energieverbrauch führt zu einer der größten Herausforderungen des
heutigen Gesundheitswesens, der Folge von Übergewicht und Adipositas (Friedman,
2000). Deren multifaktorielle Genese ist neben genetischen Polymorphismen (Wardle et
al., 2008) hauptsächlich durch die positive Energiebilanz des Organismus bedingt
(Ogunbode et al., 2011).
Seit Mitte des letzten Jahrhunderts steigt die Prävalenz dieser über das Normalmaß
hinausgehenden Vermehrung des Körperfetts weltweit stark an (James, 2004) und wird
mittlerweile von der WHO als „globale Epidemie“ angesehen (WHO, 2000). Diese
Entwicklung ist in medizinischer und finanzieller Hinsicht besorgniserregend. Übergewicht
und Adipositas erhöhen die Inzidenz assoziierter Komorbiditäten (u.a. Diabetes mellitus
Typ 2, kardiovaskuläre Erkrankungen und maligne Entartungen), korrelieren positiv mit
der Gesamtmortalität betroffener Menschen (Ahima und Lazar, 2013; Flegal et al., 2013)
und verursachen aus ökonomischer Sicht jährliche Kosten von über 10 Milliarden Euro für
das deutsche Gesundheitssystem, Tendenz steigend (Muller-Riemenschneider et al.,
2008; von Lengerke und Krauth, 2011).
Die erfolgreiche Prävention und therapeutische Intervention der Adipositas und ihrer
Begleiterkrankungen erfordert ein Verständnis der Regulation von Appetit und
Energiehomöostase.
Die weitere Aufklärung molekulargenetischer Interaktionen zwischen den an dieser
Steuerung beteiligten Hormonen Leptin und Orexin A bzw. Orexin B sowie deren
Bedeutung für den Energiestoffwechsel ist das Ziel der vorliegenden Arbeit.
h
1
Einleitung
1.1
Überblick über die Regulation der Nahrungsaufnahme und
des Energiestoffwechsels
Ein Gleichgewicht zwischen der Energieaufnahme und dem Energieverbrauch des
Körpers wird durch ein komplexes Zusammenspiel aus zentralen sowie peripheren
Signalen
und Mechanismen gewährleistet. Die
Regulation des Appetits
durch
verschiedene hypothalamische Kernregionen garantiert eine dem Bedarf entsprechende
Nährstoffaufnahme und Energieversorgung. Zentralnervös beeinflusst werden sie neben
regulierenden Neuropeptiden auch durch monoaminerge Systeme, das EndocannabinoidSystem sowie den Hirnstamm. Periphere Hunger- oder Sättigungssignale werden über
zirkulierende Substrate und Hormone vermittelt sowie intestinale Peptide, die über die
Aktivierung vagaler Afferenzen über den Nucleus tractus solitarii Einfluss auf den
Hypothalamus nehmen (Valassi et al., 2008).
Abbildung 1: Übersicht über einige an der Steuerung des Appetits beteiligten Signalwege
und Hirnregionen. AgRP: Agouti-related peptide, ARC: Nucleus arcuatus, CART: Cocaine-and
amphetamine-regulated transcript, CCK: Cholecystokinin, CRH: Corticotropin-releasing hormone,
GLP-1: Glucagon-like peptide 1, MCH: Melanin-concentrating hormone, NTS: Nucleus tractus
solitarii, NPY: Neuropeptide Y,
LHA: lateraler Hypothalamus, OXY: Oxytocin, POMC:
Proopiomelanocortin, PVN: Nucleus paraventricularis, PYY: Peptide YY, TRH: Thyrotropinreleasing hormone; modifiziert nach Valassi et al., 2008.
2
Einleitung
Zu den die Nahrungsaufnahme regulierenden hypothalamischen Kerngebieten zählen der
Nucleus arcuatus (ARC), Nucleus paraventricularis (PVN), Nucleus dorsomediale (DMH),
Nucleus ventromediale (VMH) und der laterale Hypothalamus (LH) (Dworak et al., 2011).
Der Nucleus arcuatus (ARC) befindet sich dorsal der Eminentia mediana im Bereich des
dritten Hirnventrikels und seine Neurone projizieren zur Hypophyse, zu sympathischen
sowie parasympathischen Zentren des Hirnstammes und des Rückenmarks. Neurone
dieses Kerngebietes enthalten in den Perikaryen Neuropeptide wie NPY, AgRP, POMC
und CART und beteiligen sich an emotionalen, sensorischen, autonomen und vegetativen
Funktionen (Chronwall, 1985). In Abhängigkeit vom Energiezustand des Körpers werden
diese Peptide freigesetzt und triggern orexigene oder anorexigene neuronale Antworten.
Schäden im Nucleus arcuatus führen zu Hyperphagie und begünstigen die Entstehung
von Übergewicht
Neurotransmitter
(Li et
al.,
(Serotonin,
2008;
Scallet
Noradrenalin,
und Olney,
Dopamin)
1986). Monoaminerge
interagieren
mit
diesen
Neuropeptiden und nehmen so Einfluss auf den Energiehaushalt. Serotonin aus dem
Nucleus raphe dorsalis (DR) reduziert den Appetit und erhöht den katabolen Stoffwechsel
(McMinn et al., 2000). Noradrenalin hingegen steigert den Appetit über α2- und hemmt ihn
über α1- und β-Rezeptoren. Dopamin inhibiert die Nahrungsaufnahme über den LH und
ARC und steigert ihn über den VMH (Ramos et al., 2005). Neuronale Verknüpfungen
bestehen zu den Nachbarkernen wie dem Nucleus paraventricularis (PVN). Er kann als
Schnittstelle vieler den Energiehaushalt regulierenden Neurone angesehen werden.
Veränderungen
dieses
hypothalamischen
Kerngebietes
beeinflussen
die
Nahrungsaufnahme, das Körpergewicht, die Herzfrequenz sowie die Körpertemperatur
(Hill, 2012). Neuronale Interaktionen ventraler Fasern des Nucleus dorsomediale (DMH)
mit dem ARC ermöglichen die Beeinflussung des Ernährungsverhaltens. Läsionen dieser
Kerngebiete führen zu Hypophagie, Hypodipsie und reduziertem Körperwachstum
(Bellinger und Bernardis, 2002). Gegensätzliche Folgen resultieren aus der Läsion des
Nucleus ventromediale (VMH), weswegen er früher vereinfacht als „Sättigungszentrum“
bezeichnet wurde. (King, 2006). Die Kernregion des lateralen Hypothalamus (LH) enthält
hauptsächlich drei Neuronentypen. Wie im Jahre 2013 beschrieben (Burdakov et al.,
2013), fördern LH-Orexin-Neurone überwiegend im Wachzustand die Belohnungssuche
(reward-seeking), die Widerstandsfähigkeit gegenüber der Entwicklung von Übergewicht
sowie die Thermogenese. LH-MCH-Neurone begünstigen dagegen nachts körperliche
Ruhe und Gewichtszunahme. Sie sind befähigt, die Glukosetoleranz zu beeinflussen. Die
dritte
Gruppe
stellen
Neurone
dar,
die
den
Leptinrezeptor
exprimieren
und
appetithemmend wirken sowie über einen kleinen Regelkreis innerhalb des LH als auch
über mesolimbische, dopaminerge Systeme den Appetit steuern. Neuronale Projektionen
3
Einleitung
wurden zum Cortex und zu Strukturen des Hirnstammes und des Rückenmarkes
nachgewiesen (Elmquist et al., 1999). Neben dem Neuropeptid- und monoaminergem
System beteiligt sich das Endocannabinoid-System (ECS) u.a. an der Steuerung des
Appetits und des Energiestoffwechsels. Der überwiegend im ZNS und teilweise in
peripherem Gewebe exprimierte CB1-Rezeptor vermittelt eine Cannaboid-induzierte
Steigerung der Nahrungsaufnahme und der Lipogenese. Darüber hinaus begünstigt das
ECS eine Gewichtszunahme durch Störung der Glukosetoleranz, bedingt durch eine
verringerte Insulinsensitivität. Die Identifizierung von Cannaboidrezeptoren im peripheren
Gewebe, insbesondere in den Inselzellen des Pankreas und der dortigen Erhöhung der
Insulinsekretion
mildert
Insulinresistenz.
Bei
unter
erhöhter
normalen
Aktivität
Umständen
des
ECS
die
Hyperglykämie
überwiegt
die
bei
gesteigerte
Insulinfreisetzung und begünstigt die anabole Stoffwechsellage mit Erhöhung des
Körpergewichtes (Li et al., 2011). Die genannten zentralen Regelkreise erhalten
zusätzliche Informationen über den Energiezustand des Körpers aus der Peripherie. In
Abhängigkeit vom Füllungszustand des Gastrointestinaltraktes wird entweder ein Hungeroder Sättigungsgefühl ausgelöst (Geliebter et al., 1988). Vermittler der anorexigenen
Signale sind neben den Dehnungsrezeptoren des Magens auch die intestinalen Peptide
Cholecystokinin (CKK), Glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) und Peptide YY (PYY). Das
einzige derzeit bekannte orexigene Peptid des GI-Traktes ist das Ghrelin. Diese
genannten Peptide beeinflussen über den Nucleus vagus und den Nucleus tractus solitarii
die hypothalamischen Kerngebiete, die ebenfalls appetithemmende Signale der Hormone
Leptin und Insulin verarbeiten.
1.2
Leptin und der Energiehaushalt
Im Jahre 1994 wurde durch Positionsklonierung des Obese-Gens durch Zhang et al. eine
der bedeutendsten Entdeckungen zum Verständnis der neuronalen Stoffwechselkontrolle
erzielt. Dieses 650 kb große Gen kodiert für das 167 Aminosäuren große Hormon Leptin,
welches überwiegend von Adipozyten des weißen Fettgewebes synthetisiert und
sezerniert wird (MacDougald et al., 1995; Zhang et al., 1994). Leptin beeinflusst mit
anderen
orexigenen
und
anorexigenen
Peptiden
das
Körpergewicht
und
den
Energiestoffwechsel (Bjorbaek und Kahn, 2004; Halaas et al., 1995) über direkte Wirkung
auf
hypothalamische
Areale,
die
Nahrungsaufnahme,
Körpertemperatur
und
Energieverbrauch kontrollieren (Szekely et al., 2010). Darüber hinaus besitzt Leptin
weitere neuroendokrine Funktionen (Pralong und Gaillard, 2001) und beeinflusst die
4
Einleitung
hypothalamisch-hypophysäre-adrenale Achse (Gaillard et al., 2000; Glasow und
Bornstein, 2000). Leptinspiegel im Serum stehen im starkem Zusammenhang mit der
Körperfettmasse des Organismus (Frederich et al., 1995; Maffei et al., 1995). Geringe
Serumspiegel
können
jedoch
auch
Hinweise
auf
seltene
genetisch
bedingte
Erkrankungen wie Lipodystrophie oder eine angeborene Leptinresistenz geben (Gautron
und Elmquist, 2011). Mutationen in Gensequenzen, die für Leptin oder Leptinrezeptoren
kodieren, führen zu starkem Übergewicht (Chua et al., 1996; Pelleymounter et al., 1995)
sowie zu Diabetes und anderen neuroendokrinen Störungen (Campfield et al., 1995;
Pelleymounter et al., 1995). Seine Wirkung entfaltet Leptin über den eigenen
Leptinrezeptor, der zu der Klasse I der Zytokin-Superfamilie und wiederum zu der IL-6Rezeptor-Familie gehört (Ghilardi und Skoda, 1997). Der Rezeptor benötigt als RezeptorTyrosinkinase,
wie
andere
Zytokinrezeptoren
auch,
die
Funktionalität
der
rezeptorassoziierten Januskinase 2 (JAK2) (Haan et al., 2006). Die längere Isoform des
Rezeptors (ObRb) gilt neben den kürzen Varianten (ObRa, ObRc, ObRd, ObRf) und der
löslichen Form (ObRe) als Hauptvermittler der Wirkungen seines Liganden (Wilcke und
Walum, 2000).
Abbildung 2: Signaltransduktion des
aktivierten Leptinrezeptors. Modifiziert
nach Poeggeler et al., 2010.
5
Einleitung
Einer der für die Energiehomöostase bedeutendsten Transkriptionsfaktoren, welcher über
den Leptinrezeptor aktiviert wird, ist der signal transducer and activator of transcription 3
(STAT3). Eine Leptinresistenz mit Einschränkung der STAT3-Signaltransduktion ist mit
Übergewicht assoziiert (Morrison, 2008). Der durch Dimerisierung des phosphorylierten
STAT3 aktivierte suppressor of cytokine signaling (SOCS3) reguliert als STAT-induced
STAT inhibitor (SSI) den JAK-STAT-Signalweg in Form negativer Rückkopplungshemmung und beeinflusst andererseits direkt die Transkription (Minamoto et al., 1997).
Weiterhin aktiviert die janus kinase 2 (JAK2) über das insulin receptor substrate (IRS) die
phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K)
(Sanchez-Margalet
et
al.,
2003).
Die
vom
Leptinrezeptor aktivierte Tyrosinphosphatase SHP-2 reguliert über Ras- und mehrere
andere Proteine die p44/42-MAPK (ERK 1/2) (Cunnick et al., 2002). Über diese
Signalwege wird sowohl die Transkription (c-fos, SOCS-3) im Zellkern als auch die
Aktivierung von Ionenkanälen über die PI3K gesteuert (Plum et al., 2006). Neben der
Regulation der Nahrungsaufnahme führen Interaktionen mit dem mitochondrialen
Metabolismus zur Beeinflussung der Energiehomöostase (Guo et al., 2008; Luo et al.,
2008).
Das
Hormon
Leptin
ist
somit
entscheidend
an
der
Aufrechterhaltung
eines
ausgeglichenen Energiestoffwechsels beteiligt.
1.3
Die Rolle der Orexine für die Ernährung und Energiebilanz
Das Screening von HPLC-Fraktionen durch Sakurai et. al. führte 1998 zur Entdeckung der
Neuropeptide Orexin A und Orexin B im lateralen und posterioren Hypothalamus der
Ratte. Sie repräsentieren Endprodukte der Prozessierung der Prepro-Orexin (PPO)mRNA. Ihre Wirkung entfalten sie über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren,
den OX1- und OX2-Rezeptoren. Über den Nachweis der erhöhten Nahrungsaufnahme
nach intracerebroventrikulärer Injektion von Orexin A und die Erhöhung der PPO-mRNAExpression nach Nahrungskarenz konnte die physiologische Rolle der Orexine in der
Regulation der Nahrungsaufnahme und der Energiebilanz aufgezeigt werden (Sakurai et
al., 1998). Im gleichen Jahr konnte die Arbeitsgruppe um de Lecea die mRNA des PPO
im Hypothalamus der Ratte identifizieren. Sie bezeichneten die nach Prozessierung der
RNA entstehenden Proteine mit Hypocretin 1 und Hypocretin 2 (de Lecea et al., 1998).
Chemische Analysen ergaben, dass Hypocretin 1 und Orexin A sowie Hypocretin 2 und
Orexin B identisch sind. Die beiden Peptide werden überwiegend in Neuronen des
lateralen Hypothalamus gebildet (Elias et al., 1998). Diese Hirnregion ist bekannt für die
6
Einleitung
Steuerung des Ernährungsverhaltens sowie der Energiebilanz und Vigilanz (Sakurai et
al., 1998). Intrathalamisch projizieren orexinproduzierende Neurone zum Nucleus
suprachiasmaticus, Nucleus paraventricularis, Nucleus supraopticus, Nucleus arcuatus
und Nucleus tuberomamillaris. Innerhalb des Gehirns sind Verbindungen zum
motorischen und sensorischen Cortex, Hippocampus, Corpus amygdaloideum, Bulbus
olfactorius, Broca-Areal, Raphe-Kernen, Nucleus dorsalis nervi vagi, Stria terminalis,
Thalamus und Locus coeruleus sowie dem Kleinhirn beschrieben (Girault et al., 2012).
Doch auch periphere Effekte der Orexine und die Expression der Orexinrezeptoren
außerhalb des zentralen Nervensystems sind bekannt (Jöhren et al., 2001) und
verdeutlichen die Funktion des Orexinsystems als Schnittstelle zwischen mehreren
regulatorischen Systemen, die die Energiehomöostase, das Belohnungsverhalten und
emotionale, autonome und endokrine Reaktionen steuern. Beeinflusst werden die
orexinproduzierenden Neurone sowohl von anderen Hirnregionen als auch von
peripheren metabolischen Signalen wie den Plasmaspiegeln von Glukose, Leptin und
Ghrelin (Mieda und Sakurai, 2012). Neben der Kontrolle der Energieaufnahme und
Energiebilanz wird den Orexinen eine bedeutende Rolle bei der Steuerung des
Schlaf/Wachverhaltens und des Erregungsniveaus zugeschrieben. Mäuse mit genetischer
Ablation der Orexin-Neurone sowie Menschen mit Narkolepsie durch Orexindefizienz
neigen zu Übergewicht (Hara et al., 2001; Kok et al., 2003). Die zentrale Injektion von
Orexinen führt bei Ratten zu einer Erhöhung des Symphatikotonus mit erhöhten
Plasmaspiegeln
von
Glukose
und
Corticosteron
sowie
einer
Steigerung
der
lokomotorischen Aktivität (Vanitallie, 2006). Bei der Entdeckung 1998 konnten Sakurai et
al. zunächst zeigen, dass die intracerebroventrikuläre Injektion von Orexin A zu einer
kurzfristigen Steigerung der Nahrungsaufnahme führt und die Orexin-mRNA-Expression
unter
Nahrungskarenz stimuliert wird (Sakurai et al., 1998). Der Nachweis
orexinproduzierender
Ernährungszentrum
Neurone
führte
im
zunächst
lateralen
zu
der
Hypothalamus
Ansicht,
als
Orexine
regulierendem
würden
die
Nahrungsaufnahme stets erhöhen.
7
Einleitung
Abbildung 3: Das Orexinsystem als Schnittstelle zwischen mehreren regulatorischen
Systemen, die die Ernährung, das Belohnungsverhalten, emotionale Reaktionen und autonome
sowie endokrine Reaktionen steuern. Orexinproduzierende Neurone im lateralen (LHA) und
posterioren Hypothalamus (PH) sind anatomisch günstig gelegen, um das limbische System,
Systeme der Energiehomöostase und die Vigilanz fördernde monoaminerge Neurone des
Hirnstamms miteinander zu verbinden. Konstante Pfeile kennzeichnen exzitatorische Projektionen,
gestrichelte Pfeile dagegen inhibitorische Projektionen. (BST: „bed nucleus“ der Stria terminalis,
DMH: dorsomedialer Hypothalamus, DR: Nucleus raphe dorsalis, GABA: γ-Aminobuttersäure, LC:
Locus coeruleus, SCN: Nucleus suprachiasmaticus, TMN: Nucleus tuberomamillaris, VLPO: Area
preoptica ventrolateralis, VTA: Area tegmentalis ventralis; modifiziert auf der Grundlage von Mieda
und Sakurai, 2012, Seite 10, Abb. 1.
Bestätigt wurde diese Annahme durch Tiermodelle mit Deletion der genetischen
Information für Orexine. Diese „Orexin-Knockout-Mäuse“ zeichneten sich durch
Hypophagie aus (Hara et al., 2001; Willie et al., 2001).
Allerdings
wurde
in
den
Folgejahren
offensichtlich,
dass
die
Regulation
des
Ernährungsverhaltens durch Orexine weitaus komplexer ist. Die chronische Gabe von
Orexin A über 24 Stunden erhöht weder die Gesamtnahrungsaufnahme noch das
Körpergewicht (Xu et al., 2004). Jüngst konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe
eines
selektiven
OX2R-Agonisten
die
Nahrungsaufnahme
von
Mäusen
unter
hochkalorischer Ernährung reduziert und die Entwicklung von Übergewicht zu hemmen
vermag (Funato et al., 2009). Nach aktuellem Forschungsstand kann angenommen
werden, dass Orexine die Nahrungsaufnahme steigern, aber auch senken können, jeweils
abhängig von der Tageszeit und dem Energiestatus des Organismus, der über periphere
metabolische Signale als auch durch direkte neuronale Verbindungen erfasst wird
8
Einleitung
(Espana et al., 2002; Tsuneki et al., 2010). Auf intrazellulärer Ebene wurde die Rolle des
Transkriptionsfaktors Foxa2 erforscht, der als Reaktion auf die negative Energiebilanz des
Körpers an den Orexin-Promotor bindet und nachfolgend die Transkription stimuliert (Silva
et al., 2009). Abgesehen von der Regulation der Ernährung kommt den Orexinen eine
bedeutende Rolle in der Steuerung der Wachheit und Vigilanz zu. Eine Orexindefizienz
führt sowohl bei Tieren als auch beim Menschen zum Krankheitsbild der Narkolepsie,
einer Störung des Schlaf-Wach-Rhythmus (Hara et al., 2001). Orexin-Neurone projizieren
auch zum Hirnstamm und Rückenmark und üben so Einfluss auf das autonome und
sympathische Nervensystem aus (Oldfield et al., 2007; Shiuchi et al., 2009). Über
neuronale Projektionen in den Corpus amygdaloideum, die Area septalis des Septum
telencephali, die Area preoptica und Komponenten des mesolimbischen Systems üben
Orexine Einfluss auf das emotionale Verhalten und das Belohnungszentrum aus (Baldo et
al., 2003; Espana et al., 2005). Abhängig von der Aktivität des Belohnungssystems
regulieren Orexine die Wahl und Menge der aufgenommenen hochkalorischer
Nahrungsmittel,
während
der Anreiz
zur
Aufnahme
energiearmer
Lebensmittel
unverändert bleibt (Borgland et al., 2009). Das Orexinsystem reguliert darüber hinaus die
lokomotorische Aktivität über das mesolimbische, dopaminerge System. Dies impliziert die
Verknüpfung zwischen Energiestatus, Belohnungssystem und Beeinflussung des
Verhaltens. Die Stimulation mit Orexinen erhöht die lokomotorische Aktivität, während die
Behandlung mit Orexinrezeptor-Antagonisten die physische Aktivität verringert (Nakamura
et al., 2000; Narita et al., 2006). Ratten mit Orexindefizienz imponieren durch verringerte
lokomotorische
Aktivität,
während
die
kompensatorische
Abnahme
der
Nahrungsaufnahme ausbleibt und zu Übergewicht bei diesen Tieren führt (Hara et al.,
2001). Das Orexinsystem beeinflusst somit die Energiebilanz über eine komplexe
Steuerung der Nahrungsaufnahme, der Wachheit und der physischen Aktivität. Über
periphere und zentrale Signale erhalten Orexin-Neurone Informationen über den
Energiezustand und die Wachheit des Organismus. Über neuronale Projektionen steuern
Orexine mehrere an der Regulation des Energiehaushaltes beteiligte Hirnregionen.
Während
der
Nacht
inhibiert
der
Nucleus
suprachiasmaticus
über
GABAerge
Mechanismen die Aktivität der Orexin-Neurone. Lässt diese nach, triggern Orexine die
Wachheit, den Erregungszustand und die Nahrungsaufnahme. Über Beteiligung an
bedeutenden regulatorischen Systemen beteiligen sich Orexine an der Aufrechterhaltung
der Energiehomöostase. Jede Störung dieses Systems fördert die Entwicklung des
metabolischen Syndroms (Girault et al., 2012).
9
Einleitung
1.4
Interaktionen zwischen Leptin- und Orexinsystem
Das Leptin ist an der zentralen Regulation der Energiebilanz beteiligt, indem es sowohl
mit orexigenen als auch anorexigenen Systemen interagiert und den Energiestatus des
Organismus reflektiert (Gautron und Elmquist, 2011). Auch das Orexinsystem ist ein
bedeutender Modulator der Energiehomöostase. Orexine können einerseits die
Entwicklung einer peripheren Insulinresistenz verzögern, andererseits führt eine erhöhte
Signaltransduktion über den OX2-Rezeptor zu einer erhöhten Widerstandsfähigkeit
gegenüber der Entwicklung von Adipositas unter hochkalorischer Ernährung, bedingt
durch eine erhöhte Leptinsensitivität. Die regelrechte Funktion der leptinvermittelten
Signaltransduktion ist dabei essentiell für die Wirkungen der Orexine (Funato et al., 2009).
Die enge Wechselwirkung zwischen Leptin und Orexinen und deren Bedeutung für eine
ausgeglichene Energiebilanz konnte an ob/ob- und db/db-Mausmodellen verdeutlicht
werden.
Diese
am
metabolischen
Syndrom
erkrankenden
Tiere
zeigen
eine
herabregulierte Genexpression des PPO, bedingt durch eine Hyperglykämie bei
verminderter Insulinsensitivität (Yamamoto et al., 1999; Yamanaka et al., 2003). Diese
herabgesetzte Produktion der Orexine fördert die Insulinresistenz. Eine Stimulation der
Orexinrezeptoren (besonders des OX2R) und nachfolgender Signaltransduktion kann als
neue Strategie angesehen werden, um die Entwicklung eines metabolischen Syndroms
einschließlich Adipositas, Hypertonie, Dyslipidämie und Insulinresistenz zu begrenzen.
Die intrazelluläre Kopplung zwischen orexin- und leptinvermittelten Signalwegen und die
synergistische Wirkung auf die Energiehomöostase sind bislang nicht erforscht. Diese
Untersuchungen erscheinen notwendig, um die Rolle der Orexine für die Energie- und
Stoffwechsellage besser zu verstehen und weitere therapeutische Möglichkeiten u.a. bei
der Behandlung von Diabetes mellitus und metabolischem Syndrom zu gewinnen.
1.5
Zielsetzung der Arbeit
Zentrales Thema der vorliegenden Arbeit ist der intrazelluläre Einfluss des Orexinsystems
auf die leptinregulierte Genexpression hypothalamischer, appetitregulierender Peptide
sowie deren molekulare Mechanismen der Interaktion. Dafür wurde die immortalisierte,
hypothalamische Zelllinie „mHypoA-2/23“ erstmals als Modellsystem etabliert.
10
Einleitung
Es wurden folgende Fragestellungen genauer untersucht:
1) Eignet sich die hypothalamische Zelllinie mHypoA-2/23 als Modellsystem zur
Untersuchung der Interaktionen zwischen dem Leptin- und Orexinsystem?
Zum aktuellen Zeitpunkt gibt es keine Vorarbeiten mit dieser erst seit kurzem
kommerziell erhältlichen Zelllinie (CEDARLANE Laboratories Limited). Sie wurde
aufgrund eines geeigneten Expressionsprofils gewählt und wurde nun erstmals
funktionell charakterisiert und etabliert. Dafür wurde die mRNA-Basalexpression
appetitregulierender Peptide sowie relevanter Rezeptoren untersucht und mit der
Expression anderer hypothalamischer Zelllinien verglichen.
2) Verändert
die gleichzeitige Gabe von Leptin und Orexin A bzw. B die
Genexpression hypothalamischer, appetitregulierender Peptide gegenüber einer
Einzelstimulation?
Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass eine transgene Überexpression von
Orexinen
bei
Mäusen
eine
Resistenz
gegenüber
hochkalorischer,
ernährungsbedingter Fettleibigkeit und Insulinunempfindlichkeit verleiht, bedingt durch
eine Förderung des Energieverbrauches und einer verringerten Nahrungszufuhr
(Funato et al., 2009). Dieser Effekt war abhängig von der Funktionalität des
Leptinsignalweges. Diese molekularen Mechanismen sind zum gegenwärtigen
Zeitpunkt nicht bekannt. In Zellkulturversuchen wurden in der vorliegenden Arbeit
Effekte von Doppelstimulationen auf die Genexpression relevanter Neuropeptide mit
den Effekten nach Einzelstimulationen verglichen.
3) Erfolgt
eine
Modulation
der
Genexpression
transkriptionell
oder
posttranskriptionell?
Um die Frage nach dem Ort der Modulation zu klären, wurde Actinomycin D, ein
Hemmstoff der DNA-abhängigen RNA-Synthese, verwendet. Dieser ermöglichte in
Kulturversuchen
die
Unterscheidung
zwischen
transkriptionellen
und
posttranskriptionellen Effekten.
11
Einleitung
4) Welche intrazellulären Signalwege werden beeinflusst und vermitteln potentielle
Effekte?
Welche zellulären Signalwege an einer Interaktion beteiligt sind, ist bislang ungeklärt.
Daher sind die Regulationsmechanismen, die für den potentiell protektiven Effekt von
Orexinen auf die leptinspezifische Steuerung des Hungergefühls eine Rolle spielen,
Gegenstand
der
hier
vorgestellten
Studie.
Dazu
wurden
durch
Rezeptor-
Tyrosinkinasen und -phosphatasen aktivierte Signalwege untersucht (JAK-STATSignalweg, MAP-Kinase-Signalweg) sowie Veränderungen der intrazellulären Ca2+Konzentration.
Abbildung 4: Übersicht über Möglichkeiten molekularer Interaktion der
Signaltransduktion nach ObRb-, OX1- und OX2-Rezeptorstimulation.
12
2.
Material und Methoden
2.1
Material
Eine Auflistung der verwendeten
verwendete Geräte und Materialien ist dem Anhang zu entnehmen.
entnehme
2.2
Methoden
2.2.1 Zellkultur
Für diese Arbeit wurde der neuronale
Zelltyp mHypoA-2/23
2/23 verwendet, der
bei der Firma CELLutions Biosystems
Inc. kommerziell erhältlich ist. Diese
Neurone
stammen
aus
der
hypothalamischen Primärkultur einer
2 Monate alten Maus (C57Bl/6) und
wurden
durch
Transfer des
Antigens
Abbildung
5::
Morphologie
der
mHypoA 2/23-Neurone.
Neurone. Dargestellt ist
das mikroskopische Bild bei 80x
Vergrößerung
rgrößerung und dreitägiger
dreit
Kulturzeit
den
retroviralen
Simian virus-40-Tvirus
immortalisiert.
Diese
Zelllinie wurde als Monolayer-Kultur
Monolayer
in
diesem
untersucht
Projekt
und
zunächst
etabliert.
Die
Kultivierung dieser Zellen erfolgte bei
37 °C und 5 % CO 2 in zwei 25 ml
Kulturflaschen (Wachstumsfläche: 12,5 cm²).
cm²). Als Nährmedium dienten 13 ml DMEM
(Dulbecco's
Dulbecco's Modified Eagle Medium)
Medium mit einem
Anteil von 10 % FBS (Fetal
(
Bovine
Serum, PAA A15-751) sowie 5 % Penicillin/Streptomycin (10.000
10.000 Einheiten Penicillin,
10.000 µg
g Streptomycin/ml).
Streptomycin/ml Jegliche Bearbeitung
itung dieser Zellkulturen fand bei keimarmen
Bedingungen unter der Reinraumbank statt. Konnten nach dem Mikroskopieren sichtbare
Kontaminationen ausgeschlossen werden, wurden die Zellen bei einer Konfluenz von 8080
90 % zweimal wöchentlich subkultiviert.
subkultivie Dafür wurde das Kulturmedium abgesaugt und
die Zellen zweimal mit 37 °C warmem PBS (Phosphate buffered saline) gewaschen .
Anschließend wurden 3 ml Trypsin
Tryp
auf der Zellkultur verteilt und für 1 - 2 Minuten darauf
belassen (Detachment).. Nach der Entfernung des Trypsins wurden die Neurone durch
leichtes Beklopfen von der Flaschenoberfläche gelöst, bevor sie mit 10 ml 37 °C warmem
13
Material und Methoden
DMEM in Suspension gebracht wurden. 0,5 ml bzw. 1 ml dieser Suspension wurden den
13 ml Grundmedium der neuen Kulturflaschen hinzugegeben. In regelmäßigen Abständen
wurden die Kulturen auf Kontamination durch Mykoplasmen untersucht.
2.2.2 Zellkultivierung für Versuche
Für die Versuche wurde die oben erwähnte Zellsuspension mit DMEM + FBS ohne Zusatz
von Penicillin/Streptomycin hergestellt, um eine Beeinflussung der Zellfunktionen durch
diese Substanzen in anschließenden Experimenten auszuschließen. Ein Teil dieser
Suspension ist mit DMEM + FBS bis zu einer Zellkonzentration von 2 x 105 Zellen/ml
verdünnt worden. Diese wurde je nach Versuch auf eine 24 Well-Platte bzw. 6 Well-Platte
pipettiert. Nach 24 bis 36 Stunden Kultivierung wurden die entsprechenden Versuche
durchgeführt. Für Experimente, bei denen die Zellen mit Hormonen stimuliert werden
sollten, wurde das Grundmedium zunächst abgesaugt und das Well mit PBS gewaschen.
Anschließend wurde das neue Medium, mit den darin enthaltenden Stimulanzien,
hinzugegeben. Ein Entzug des Serums führte nach 12 Stunden Kultivierung zum Zelltod
der hier verwendeten Neurone, weshalb auf Versuchsabläufe ohne Serumanteil im
Nährmedium verzichtet wurde.
2.2.3 RNA-Extraktion
Die RNA-Extraktion aus den behandelten Zellkulturen erfolgte mit Hilfe der ABI PRISM™
6100 Nucleic Acid Prep Station.
Zum Beenden der Versuche wurde das Kulturmedium inklusive der eventuell darin
enthaltenden Stimulanzien abgesaugt und jedes Well zwei Mal mit PBS (Purification Lysis
Solution
and
calcium/magnesium-free
phosphate-buffered
saline)
gewaschen.
Anschließend erfolgte die Zelllyse und RNAsen-Inaktivierung durch Zugabe von 500 µl
RNA 1X lysis Puffer und PBS im Verhältnis 1 : 1. Nach 2 bis 3 Minuten wurde die
Suspension in Eppendorfgefäße überführt und die darin enthaltende RNA mit der ABI
PRISM™ 6100 Nucleic Acid Prep Station nach dem Protokoll „Isolation of total RNA from
cultured cells“ (Applied Biosystems, 2004) isoliert.
h
14
Material und Methoden
2.2.4 RNA-Quantifizierung mit RiboGreen®
Zur RNA-Quantifizierung wurde das Quant-iTTM-RiboGreen®-RNA-Assay-Kit verwendet.
Die Grundlage dieser Methode ist die Bindung des Fluoreszenzfarbstoffes RiboGreen®
an in Lösung befindliche Nukleinsäuren. Die Messung wurde nach dem Protokoll „QuantiTTM RiboGreen RNA Reagent and Kit“ (Invitrogen, 2005) durchgeführt. Daraus ableitend
wurden folgende Konzentrationen zur Herstellung einer Eichgeraden hergestellt:
TE-Puffer
0 µl
500 µl
900 µl
980 µl
1000 µl
100ng/ml-RNAStammlösung
1000 µl
500 µl
100 µl
20 µl
0 µl
Quant-iT™
RiboGreen®-Reagenz
1000 µl
1000 µl
1000 µl
1000 µl
1000 µl
finale RNAKonzentration
50 ng/ml
25 ng/ml
5 ng/ml
1 ng/ml
-
Die RNA-Proben wurden im Verhältnis 1 : 50 verdünnt, damit die Konzentration innerhalb
des von der Standardgerade abgedeckten Bereiches lag.
Das Absorptionsmaximum von an RNA gebundenem RiboGreen® liegt bei etwa 500 nm,
bei einem Emissionsmaximum von etwa 525 nm. Die RNA-Quantifizierung wurde im
„FLUOstar Optima Microplate Fluorometer“ der Firma BMG LABTECH durchgeführt. Dazu
ist eine 96-Well-Platte für die Proben verwendet worden. Die Messung wurde mit einer
festgelegten Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 520
nm durchgeführt. Die dann gemessenen Werte wurden durch Subtraktion des „blank“Wertes angepasst und die RNA-Konzentration mit Hilfe der Standardkurve bestimmt.
Abschließend wurden die jeweiligen Konzentrationen unter Berücksichtigung des
gewählten Verdünnungsfaktors errechnet.
15
Material und Methoden
2.2.5 Reverse Transkription (cDNA-Synthese)
I ) Pool für die Oligo (dT)-Primer-Anlagerung:
dNTP Mix
(10 mM)
2 µl je Probe
Oligo (dT)20
(50 µM)
1 µl je Probe
II ) Pool für die reverse Transkription:
5X cDNA Synthese Puffer
4 µl je Probe
DEPC-Wasser
1 µl je Probe
DTT
(0,1 M)
1 µl je Probe
RNaseOUT
(40 U/µl)
1 µl je Probe
Cloned AMV RT
(15 U/µl)
1 µl je Probe
Die cDNA-Synthese aus den RNA-Proben wurde mit Hilfe des von Invitrogen
hergestellten cDNA-Synthese-Kits (Cloned AMV First-Strand Kit, Invitrogen) durchgeführt.
Die Grundlage dieser Methode bildet die AMV Reverse Transkriptase, eine RNAabhängige DNA-Polymerase, die aus dem „Avian Myeloblastosis Virus“ stammt. Ein 20
Basenpaare großer Oligo-(dT)-Primer lagert sich an den Poly-(A)-Strang (dem 3´-Ende
der RNA) an und dient somit als Startsequenz der DNA-Polymerase. Diese verlängert die
Startsequenz, bis der Einzelstrang vollständig in einen Doppelstrang überführt wurde.
Dazu wurden im ersten Schritt 9 µl der extrahierten RNA mit 1 µl Oligo (dT)20 und 2 µl
dNTP Mix für 5 Minuten in einem Thermocycler bei 65 °C inkubiert, um durch
Denaturierung der Primärstruktur von Nukleinsäuren die Anlagerung der Primer zu
ermöglichen.
Im Anschluss wurden diese 12 µl mit 4 µl 5X cDNA Synthesis Buffer, 1 µl DTT, 1 µl
DEPC-Wasser, 1 µl RNaseOUT und 1 µl Cloned AMV RT auf das Gesamtvolumen von 20
µl ergänzt. Diese Lösung wurde dann im 2. Schritt 60 Minuten lang bei 50 °C inkubiert,
wobei der komplementäre Strang synthetisiert werden konnte. Durch 5-minütiges Erhitzen
auf 85 °C ist die DNA-Polymerase inaktiviert worden . Diese cDNA wurde im letzten Schritt
mit DEPC-Wasser auf das Volumen von 40 µl verdünnt (Verhältnis 1 : 1) und bei -20 °C
im Gefrierschrank gelagert.
16
Material und Methoden
2.2.6 Quantitative Echtzeit-PCR (q-PCR)
Die Erstbeschreibung der von Kary Mullis entwickelten PCR (Saiki et al., 1985) erfolgte im
Jahre 1985 und ermöglichte erstmals eine spezifische Amplifikation einer Zielsequenz in
der DNA. Diese bis heute weiterentwickelte Methode basiert auf dem mehrmaligen
Durchlaufen eines PCR-Amplifizierungszyklus, der aus Strangtrennung, Hybridisierung
der Primer und DNA-Synthese besteht. Für die Durchführung einer PCR benötigt man
eine Lösung mit DNA und darin enthaltener Zielsequenz, ein an den flankierenden
Sequenzen hybridisierendes Primerpaar, die 4 Desoxyribonucleosid-triphosphate (dNTPs)
und eine hitzestabile DNA-Polymerase.
Diese Amplifizierungszyklen werden durch Temperaturänderung des Reaktionsgemisches
mehrfach wiederholt, ohne Substanzen erneut hinzugeben zu müssen.
Im ersten Schritt führt ein 15-sekündiges Erhitzen auf 95 °C zu einer Strangtrennung der
vorhandenen DNA. Im folgenden Schritt führt ein schnelles Abkühlen auf 55 - 60 °C zu
einer Primerhybridisierung am 3‘ Ende der Zielsequenz. Indem diese 20 - 30 Nukleotide
langen Primer dem Reaktionsgemisch im Überfluss dazu gegeben werden, ist eine
Rückbildung des ursprünglichen DNA-Moleküls nahezu ausgeschlossen. Im dritten Schritt
führt das Erhitzen auf 72 °C zu einer optimalen Tem peratur für die Taq-DNA-Polymerase,
welche beide Primer in Richtung der Zielsequenz verlängert. Am Ende des dritten Zyklus
liegen erstmals zwei kurze Stränge vor, die nur die gewünschte Sequenz enthalten. Alle
folgenden Zyklen vervielfachen diese Zielsequenz unter Idealbedingungen exponentiell. In
diesem Fall ist die Sequenz nach n-Zyklen um das 2n-Fache amplifiziert worden.
(nach Stryer-Biochemie, 6. Auflage, 2007, S. 155).
Die 1993 durch Higuchi et al. erstbeschriebene quantitative Echtzeit-PCR (q-PCR)
(Higuchi et al., 1993) ermöglicht die Bestimmung der Menge an amplifizierter DNA. Diese
Methode wurde auch für die PCR-Durchführung bei entsprechenden Experimenten dieses
Projektes verwendet. Die Quantifizierung wird durch einen DNA-bindenden FluoreszenzFarbstoff ermöglicht, dessen Emissionen von einer CCD-Kamera detektiert werden. Eine
mitgeführte Standardreihe ermöglicht eine Bestimmung der anfänglichen Kopienzahl bei
den zu untersuchenden Proben.
Oligonukleotide, die als Startpunkt für DNA-Polymerasen dienen, werden als Primer
bezeichnet und dienten in vorliegendem Projekt der Amplifikation von DNA mit Hilfe der
PCR.
17
Material und Methoden
Beim Primerdesign sollten folgende Regeln beachtet werden. Der Anteil von Guanosin
und Cytosin in der Primersequenz sollte zwischen 40 und 60 % liegen. Es sollten nicht
mehr als drei gleiche Basen hintereinander liegen. Der Schmelzpunkt liegt idealerweise
zwischen 55 und 80 °C. Darüber hinaus sollte sich a m 3’-Ende ein Guanosin- oder ein
Cytosin-Rest befinden. Der Primer sollte auch nur an einer spezifischen Struktur innerhalb
der Ziel-DNA binden. Weiterhin sollten Sekundärstrukturen innerhalb eines Primers
(sogenannte Hairpin-Strukturen) vermieden werden und die beiden Primer eines
Primerpaares nicht untereinander hybridisieren können (vor allem nicht an ihren 3’Enden), um Dimerbildung zu umgehen (Lenhardt, 2007).
Primer
m NPY
m AgRP
m MCH
m CRH
m POMC
m CART
m TH
m SF-1
m PPO
m ß-Actin
m OX1R
m OX2R
m LepR
Sequenz (sense/antisense)
5`-TCG CTC TAT CTC TGC TCG TGT G- 3`
5`-AGT ATC TGG CCA TGT CCT CTG C- 3`
5`-CGC TTC TTC AAT GCC TTT TGC- 3`
5`-ATT CTC ATC CCC TGC CTT TGC- 3`
5`-CCC AGC TGA GAA TGG AGT TCA- 3`
5`-TGC CAA CAT GGT CGG TAG ACT- 3`
5`-GAA AAT GTG GCC CCA AGG A- 3`
5`-GCC ACC CCT CAA GAA TGA ATT- 3`
5`-AGC GTT ACG GTG GCT TCA TGA- 3`
5`-TGG AAT GAG AAG ACC CCT GCA- 3`
5`-AAA GTT TGC GTT CCC CTC AGA- 3`
5`-ACA CCA TTC GAG GCA TTC TCC- 3`
5`-ACA TTT GCC CAG TTC TCC CAG- 3`
5`-CCC AAA CTC CAC AGT GAA CCA- 3`
5`-AGC TGC AAA ATC GAC AAG ACG- 3`
5`-CAT TCG ATC AGC ACG CAC A- 3`
5`-TGT TCC TGC CGT CTC TAC GAA- 3`
5`-TGG TTA CCG TTG GCC TGA A- 3`
5`-ATG GAA TCC TGT GGC ATC CAT- 3`
5`-TTC TGC ATC CTG TCA GCA ATG- 3`
5`-TTG GTG CGG AAC TGG AAA C- 3`
5`-CCA TCA GCA TCT TAG CCG TCT- 3`
5`-TTC CCG GAA CTT CTT CTG TGG- 3`
5`-TCA GCA GCA ACA GCG CTA ATC- 3`
5`-ATG CCC CAA TTT CAA ACC TG- 3`
5`-TGG AAT GGA ACC TTG AGG CTT- 3`
Größe des
Amplikons
104
107
149
104
124
100
104
104
136
139
144
111
106
Abbildung 6: Darstellung der für die PCR verwendeten Primersequenzen.
18
Material und Methoden
Für die vorliegende Arbeit wurden die geeigneten Sequenzen ausgewählt, bestellt und
anschließend optimiert. Diese Primeroptimierung erfolgte durch eine PCR, wobei neun
verschiedene Primerkonzentrationen den Proben gleicher cDNA hinzugegeben wurden.
Das Ergebnis einer im Anschluss durchgeführten Gelelektrophorese mit den neun
Produkten der PCR sollte die optimale Primerkonzentration anzeigen.
Für diese Gelelektrophorese verwendete man ein zweiprozentiges Agarosegel, dem 10
mg/ml Ethidiumbromid hinzugefügt wurde. Nach dem Hinzufügen des Ladepuffers sind
die Proben zusammen mit einem Marker auf das Gel aufgetragen und über das Gel eine
Spannung von 140 bis 240 V sowie eine Stromstärke von 400 mA für 20 Minuten angelegt
worden. Die Auswertung erfolgte unter UVB-Licht bei einer Wellenlänge von 312 nm. Die
Probe, die der dann ermittelten optimalen Primerkonzentration zu Grunde lag, konnte für
die Bestimmung der Konzentration photometrisch gemessen werden. Daraus konnten
Standardkonzentrationen für die Durchführung einer PCR angesetzt werden. Diese
wurden im Gefrierschrank bei -80 °C gelagert.
Das für die Amplifizierung des gewünschten DNA-Abschnittes verwendete Platinum®
SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG with ROX ist ein fertiger Reaktionsansatz für die
Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR. Unter Verwendung dieses „SuperMix“Ansatzes wurde zunächst ein Pool hergestellt, der sich wie folgt zusammensetzte:
I) Pool für einen PCR-Ansatz
12,5 µl/Probe
SuperMix
(10 pmol/µl)
0,75 µl/Probe
antisense-Primer (10 pmol/µl)
0,75 µl/Probe
sense-Primer
9 µl/Probe
DEPC-Wasser
Dieser Ansatz ist bis zur späteren Verwendung auf Eis gekühlt und lichtgeschützt
aufbewahrt worden.
Im Folgenden wurde eine Standardreihe mit Proben bekannter Konzentration hergestellt
und diente in Doppelbestimmung der Erstellung einer Eichgeraden. Sie deckte einen
Bereich von 108 bis 104 Kopien DNA/Well ab.
In eine 96-Well-Platte wurden 2 µl der cDNA-Probe aus einem Experiment,
beziehungsweise 2 µl
einer cDNA-Probe eines Standards vorgelegt und 23 µl vom
entsprechenden oben beschriebenen Pool hinzugefügt. Anschließend erreichte man
durch kurzes Zentrifugieren die Elimination von Luftblasen im Reaktionsansatz.
19
Material und Methoden
Die im Anschluss durchgeführte PCR-Reaktion fand im ABI PRISM 7000 Sequence
Detection System (Applied Biosystems) statt. Die für die Amplifizierungszyklen nötigen
Temperaturänderungen des Reaktionsansatzes wurden programmiert. Eine zweiminütige
Temperaturerhöhung auf 50 °C zu Beginn eines Zyklus dient der Inkubation von UDG
(Uracil-DNA-Glycosylase), welche zusammen mit dUTP den Abbau kontaminierender
PCR-Produkte sichert. Darauffolgende Temperaturerhöhung auf 95 °C für zwei Minuten
führte zur Strangtrennung, worauf 40 Zyklen folgten, die die Amplifizierung des
gewünschten DNA-Abschnittes ermöglichten. Die Messung der Fluoreszenz des an die
Nukleinsäuren bindenden SYBR® Green erfolgte bei einer Wellenlänge von 520 nm und
ermöglichte die Bestimmung der Quantität amplifizierter cDNA in jedem PCR-Zyklus, da
die Intensität direkt proportional zu der Zahl der vorhandenen Doppelstränge ist. Damit
ließen sich am Ende der PCR Rückschlüsse auf die Zahl der Ausgangskopien im
Probenansatz ziehen. Eine abschließende Analyse durchgeführter Schmelzkurven der
Produkte gewährleistete die Überprüfung der Spezifität von Primern und die Reinheit der
Proben.
2.2.7 Agarose-Gelelektrophorese
Für die Agarose-Gelelektrophorese, welche zur Überprüfung der Primerspezifität und
Primeroptimierung eingesetzt wurde, ist ein 2-prozentiges Agarosegel angesetzt worden,
welches aus 6 g Agarose gelöst in 300 ml TAE-Puffer bestand.
Im Folgenden wurde diese Lösung aufgekocht, um die Agarose in Lösung zu bringen.
Anschließend wurden 6 µl Ethidiumbromid (ein roter Phenanthridin-Farbstoff) hinzu
gegeben und in der Lösung verteilt. Nach dem Gießen in eine vorgefertigte Form konnte
die Lösung für eine Stunde aushärten. Das nun fertige Gel wurde in eine mit TAE-Puffer
gefüllte Elektrophorese-Kammer gesetzt. 12,5 µl des PCR-Produktes bzw. 2,5 µl Marker
wurden mit je 2,5 µl Ladepuffer gemischt und in die erzeugten Taschen im Gel pipettiert.
Bei einer Spannung von 220 V und 400 mA wurde die Elektrophorese für 30 Minuten
durchgeführt. Abschließend konnte unter UV-Licht eine Fotografie angefertigt werden.
Dessen Beurteilung diente dem Beweis, dass ein Primerpaar das spezifische Produkt in
der PCR erzeugte.
20
Material und Methoden
2.2.8 Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration
Das Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (Invitrogen) ermöglichte die Untersuchung der
intrazellulären Ca2+-Veränderungen auf bestimmte Stimuli.
Fluo-4 ist ein Ca2+-sensitiver Fluoreszenzfarbstoff, dessen Intensität der Emission
abhängig von der Menge an gebundenem Kalzium ist und sich daher als Indikator für
intrazelluläre Kalziumkonzentrationen eignet.
Zur Vorbereitung dieser Experimente wurden 2 x 105 Zellen pro Well in einer schwarzen
96-Well-Platte (Perkin Elmer, USA) ausgesät. Das Medium wurde abgesaugt und die
Zellen mit PBS gewaschen, um mögliche Ursachen störender Hintergrundfluoreszenz im
späteren Experiment zu beseitigen. Die Behandlung der Zellen für die Versuche erfolgte
gemäß der Anleitung des Fluo-4 NW Calcium Assay Kits. Die Zellen wurden eine Stunde
im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO 2-Anteil mit dem Fluo-4 NW-Farbstoff sowie 2,5 mM
Probenecid in HBSS beladen.
Die Messung der Fluoreszenz wurde im „FLUOstar Optima Microplate Fluorometer“ der
Firma BMG LABTECH bei Raumtemperatur durchgeführt. Als Anregungswellenlänge
wurde 485 nm und als Emissionswellenlänge
520 nm gewählt. Die verwendeten
Hormone zur Stimulation der Zellen wurden automatisch in die Wells injiziert. Als
Positivkontrolle dienten humane, adrenocorticale NCI-H295R-Zellen, deren Erhöhung der
intrazellulären Kalziumkonzentration auf Orexinstimulation bereits gezeigt werden konnte
(Wenzel et al., 2009).
2.2.9 Untersuchung der mRNA-Stabilität
Um zu untersuchen, ob signifikante Änderungen der Genexpression bestimmter
Neuropeptide über die Regulation der Transkription erfolgen, wurde der Transkriptionsund Replikationshemmer Actinomycin D verwendet. Dieses Chromopeptid interkaliert
reversibel mit doppelsträngiger DNA und blockiert die Bindung der für Transkription und
Replikation benötigten Enzyme. Nach der Zugabe dieser Substanz in das Nährmedium
war somit die mRNA-Produktion in den Zellen gehemmt und die Stabilität der
vorhandenen RNA konnte untersucht werden.
Für die Versuche wurden Zellen in einer Konzentration von 2x 105 Zellen/ml in 24-WellPlatten ausgesät und für 24 Stunden mit Nährmedium ohne Zusatz von Antibiotika
kultiviert. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Mediums, welches 0,5 mg/ml
Actinomycin D enthielt und gegebenenfalls zusätzlich Orexin A bzw. Orexin B, Leptin oder
21
Material und Methoden
deren Kombination. Dieses Medium wurde bis zum Beenden der Versuchszeit durch
Zelllyse in den Wells belassen. Abschließend erfolgte die Isolierung der RNA, die
Umwandlung in DNA und die Messung der mRNA-Menge ausgewählter Neuropeptide
mittels PCR.
2.2.10 Immunhistochemie
Zur Untersuchung der STAT3-Phosphorylierung in mHypoA-2/23-Zellen wurde eine
immunhistochemische Untersuchung durchgeführt. Zellen wurden zunächst auf ein 8-Well
Lab-Tek™ Chamber Slide™ System ausgesät und für 24 Stunden kultiviert. Diese
Chamber Slides bestehen aus einem Objektträger aus Glas und darauf aufgeklebten 8
Kammern mit einem Volumen von 0,5 ml und einer Kulturfläche von 0,8 cm2.
Anschließend erfolgte die Behandlung für 15 Minuten mit Wasser (Kontrolle), 1 µM Orexin
A, 1 µM Orexin B, 0,1 µM Leptin oder 1 µM Orexin A bzw. Orexin B + 0,1 µM Leptin.
Nach dieser Stimulation erfolgte die Weiterbehandlung nach folgendem Protokoll:
Waschen in eiskaltem PBS
1 x für 2 Minuten
Fixierung
PBS mit Formaldehyd (4 %, pH 7,4)
für 15 Minuten bei Raumtemperatur
Waschen in eiskaltem PBS
2 x für 2 Minuten
Erhöhung der Zellpermeabilität
0,3 % Triton X-100 für 10 Minuten bei
Raumtemperatur
Waschen in PBS
3 x für 2 Minuten
Blockierung der unspezifischen
Bindungsstellen
1 % BSA in (PBS + 0,1 % Tween =
Blocklösung) für 30 Minuten
Waschen in PBS
3 x für 2 Minuten
Überschichten mit dem
Primärantikörper
Inkubationszeit: 1 Stunde bei 4 °C,
phospho-STAT3 (1 : 500) in Blocklösung
Waschen in PBS
3 x für 2 Minuten
Überschichten mit dem
Sekundärantikörper
Inkubationszeit: 1 Stunde bei 4 °C,
DAPI (1 : 2000) + Alexa 488 (1 : 2000)
Waschen in PBS
3 x für 2 Minuten
22
Material und Methoden
Für die mikroskopische Analyse wurden die acht auf dem Objektträger befestigten
Kammern nach dem letzten Waschschritt entfernt. Unter Verwendung eines FluoreszenzEindeckmediums (Fluorescence Mounting Medium, Dako) und eines Deckglases konnten
die Zellen anschließend mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (CLSM)
untersucht werden. Die Bilder wurden bei einer 40-fachen Vergrößerung aufgenommen.
Durch Anregung mit ultraviolettem Licht fluoreszierte DAPI und damit die DNA der
Zellkerne, während phosphoryliertes STAT3 durch Argonlaser-Anregung bei einer
Wellenlänge von 488 nm sichtbar gemacht wurde.
2.2.11 Western Blot
Zur Vorbereitung für die Proteinisolation wurden die hypothalamischen Neurone im
Anschluss an die Stimulation mit 4 °C kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden den
Zellen 100 µl Lysepuffer für 20 Minuten hinzugegeben. Daraufhin konnte die Suspension
in Mikroküvetten überführt und bis zum weiteren Gebrauch bei -80 °C aufbewahrt werden.
Die Bestimmung der Proteinmenge erfolgte photometrisch nach Pierce. Bei dieser
Methode erfolgt die Reduktion zweiwertiger Kupferionen bei der Reaktion mit Proteinen.
Die einwertigen Kupferionen reagieren mit der Bicinchoninsäure (BCA) zu einem violetten
Farbstoff. Deren Absorption kann bei einer Wellenlänge von 562 nm photometrisch
bestimmt werden.
Somit ermittelte Proteinkonzentrationen wurden dann in Relation zu einer im gleichen
Ansatz erstellten Eichkurve gesetzt. Durch eine Dreifachbestimmung wurde zufälligen
Pipettierfehlern entgegengewirkt. Die Proteinmengen lagen üblicherweise bei 1 - 2 µg/µl.
Durch Verdünnung mit Wasser entsprechend des ermittelten Proteingehaltes der
Einzelproben wurden die Proteinkonzentrationen dann zueinander standardisiert. Die auf
das Gel aufgetragene Proteinmenge (+ Wassermenge) betrug 30 µl. Zusammen mit 15 µl
Laemmlivolumen
Elektrophoresegel
wurde
somit
eingesetzt.
ein
Vor
Gesamtvolumen
dem
Beginn
von
der
45
µl/Probe
Proteintrennung
für
ein
mittels
Polyacrylamidgelelektrophorese wurden alle Proben für 10 Minuten auf 95 °C erhitzt, um
die Proteine zu denaturieren. Ein anschließendes Schütteln gewährleistete eine adäquate
Durchmischung der Proteine in der Probe.
23
Material und Methoden
Die Verwendung von 5 µl Protein-Marker in einer separaten Geltasche diente der
eindeutigen Größenzuordnung der Proteine. Für die eigentliche Gelelektrophorese wurde
das SDS-PAGE-System nach Laemmli verwendet. Bei diesem diskontinuierlichen System
werden die Proben zunächst in einem Sammelgel konzentriert und schließlich im
Trenngel aufgetrennt. Für die durchgeführten Gelelektrophoresen hatte das Trenngel
einen Acrylamid/Bisacrylamid (37,5 : 1)-Anteil von 10 % und das Sammelgel einen Anteil
von 4 %. Die Auftrennung der Proteine erfolgte in einem speziellen Elektrophoresepuffer
bei einer angelegten Spannung von 50 Volt für 15 Minuten, welche dann auf 100 Volt
erhöht und für circa 2 Stunden beibehalten wurde. Im Folgenden wurden die
aufgetrennten Proteine im Transferpuffer bei einer Spannung von 100 V auf
Nitrozellulosemembranen transferiert. Die Transferzeit betrug 90 Minuten.
Eine Inkubation der Membranen in Blockpuffer für eine 1 Stunde führte zu einer Bindung
von Nitrozellulose an Albumin. Hierdurch konnte die unspezifische Bindung der
Primärantikörper an die Nitrozellulose unterbunden werden. Nach dem dreimaligen
Waschen der Nitrozellulosemembranen für 5 Minuten erfolgte die Inkubation mit dem
jeweils
ausgewählten
Primärantikörper
in
Primär-Antikörper-Puffer
(Konzentration
1 : 1000) bei 4 °C über Nacht. Danach wurden die Me mbranen dreimal fünf Minuten mit
Waschpuffer gewaschen und anschließend für eine Stunde mit dem Sekundärantikörper
in Blockingpuffer (Konzentration 1 : 2000) inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt
wurden die Membranen für eine Minute in eine Lösung mit Belichtungsreagenz gelegt und
durch die Peroxidaseaktivität zur Fluoreszenz angeregt. Danach erfolgte die Detektion.
Die Auswertung der Signale erfolgte densitometrisch mit dem Programm ImageJ (Version
1.42, National Institutes of Health, USA).
2.2.12 Statistische Methoden
Der Ablauf und die Anzahl der durchgeführten Versuche sind dem jeweiligen Kapitel zu
entnehmen. Die Signifikanzprüfung erfolgte bei einem Versuchsaufbau mit mehr als zwei
Gruppen sowie mehr als einer unabhängigen Variablen (Behandlung, Zeit) über einen
Two-way-ANOVA-Test (bei einer unabhängigen Variablen erfolgte die statistische Prüfung
entsprechend mit einem One-way-ANOVA-Test) und anschließendem Bonferroni-PostHoc-Test. Es wurde zweiseitig getestet mit einem gewählten Signifikanzniveau von α =
0,05. In den verwendeten Grafiken wurden Mittelwerte mit dem entsprechenden
Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. Die statistische Auswertung der Daten
erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 5.0.1, GraphPad Software, Inc.).
24
3.
Ergebnisse
3.1
Funktionelle Charakterisierung hypothalamischer mHypoA2/23-Neurone und deren Etablierung als Modellsystem
Die Aufklärung molekulargenetischer Interaktionen zwischen Orexinen und Leptin auf
hypothalamischer Ebene sowie deren Bedeutung für die Energiehomöostase erforderte
eine geeignete Neuronenpopulation, die die für diese Untersuchungen notwendigen
Peptide und Rezeptoren exprimiert. Aufgrund eines geeigneten Expressionsprofils wurden
zwei embryonale und eine adulte hypothalamische Zelllinie ausgewählt, kultiviert und mit
Hilfe der q-PCR funktionell charakterisiert. Proben muriner hypothalamischer mRNA
(C57/B16-Mauslinie) wurden als Positivkontrolle verwendet. Quantifiziert wurden für die
Regulation des Appetits und des Energiestoffwechsels relevante Neuropeptide und
Rezeptoren.
In der adulten hypothalamischen mHypoA-2/23-Zelllinie zeigte sich eine etwa dreifach
höhere Genexpression von Neuropeptide Y (NPY) und eine vierfach höhere Expression
von Agouti-related peptide (AgRP) im Vergleich zum Proopiomelanocortin (POMC) und
Cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART). Weiterhin war eine hohe
Expression von Corticotropin-releasing hormone (CRH) (90.000 Kopien/100 ng RNA) zu
erkennen (Abb. 7). Eine biologisch relevante Produktion von Tyrosine hydroxylase (TH)
und Splicing factor 1 (SF-1) konnte bei diesen Neuronen nicht detektiert werden. Beide ctWerte lagen über 35 und wurden daher als nicht relevant angesehen. Eine geringe
Expression von Prepro-Orexin (PPO) von 15.000 Kopien/ 100 ng RNA konnte
nachgewiesen werden.
Weiterhin zeigte sich eine ähnlich hohe basale Genexpression von ß-Actin bei mHypoA2/23-Zellen und im murinen Hypothalamus von über 5.000.000 Kopien/100 ng RNA.
Bei allen übrigen bereits besprochenen Genprodukten lag die Expression der mRNA im
murinen Hypothalamus jeweils über 1.000.000 Kopien/100 ng RNA mit Ausnahme des
SF-1. Bezüglich der Rezeptoren ist eine etwa dreifach höhere Genexpression vom OX2Rezeptor gegenüber dem OX1-Rezeptor ersichtlich. Die mRNA-Menge lag dabei im
Bereich der Expression des Leptinrezeptors (20.000 Kopien/100 ng RNA).
h
25
Kopienzahl / 100 ng Gesamt-RNA
5 000 000
1 000 000
100 000
50 000
0
NPY
AgRP
CRH
POMC
CART
20 000 000
1 000 000
50 000
= 170
100 000
= 520
Kopienzahl / 100 ng Gesamt-RNA
Kopienzahl / 100 ng Gesamt-RNA
Ergebnisse
0
TH
SF-1
PPO
ß- Actin
60 000
mHypoA 2/23
45 000
Hypothalamus
30 000
15 000
0
OX1R
OX2R
LepR
Abbildung 7: Charakterisierung der hypothalamischen, neuronalen mHypoA-2/23-Zelllinie
mittels q-PCR. Expression von Neuropeptide Y (NPY), Agouti-related peptide (AgRP),
Corticotropin-releasing
hormone
(CRH),
Proopiomelanocortin
(POMC),
Cocaine-and
amphetamine-regulated transcript (CART), Tyrosine hydroxylase (TH), Steroidogenic factor 1 (SF1), β-Actin and Prepro-Orexin (PPO) in mHypoA-2/23-Zellen und murinem Hypothalamus. Daten
sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (2 bis 6 unabhängige Versuche).
26
Ergebnisse
Im Vergleich zu den embryonalen hypothalamischen Zelllinien N25/2 und N41 zeigte
die adulte Zelllinie mHypoA-2/23 eine signifikant höhere Genexpression bezüglich der
untersuchten Gene (siehe Abb. 8, Ausnahme bilden CART und OX1R). Daher wurden
Kopienzahl / 100 ng Gesamt-RNA
150 000
Kopienzahl / 100 ng Gesamt-RNA
für alle folgenden Experimente die adulten Neurone verwendet.
30 000
*
*
*
*
100 000
50 000
0
NPY
AgRP
CRH
POMC
*
CART
*
*
20 000
= 520
= 530
= 420
= 170
= 340
= 190
10 000
TH
SF-1
0
mHypoA 2/23
PPO
OX1R
mHypoE N25/2
OX2R
LepR
mHypoE N41
Abbildung 8: Vergleich der basalen Genexpression mit anderen hypothalamischen
Neuronen. Expression ausgewählter appetitregulierender Neuropeptide sowie Orexin- und
Leptinrezeptor-mRNA in mHypoA-2/23-Neuronen im Vergleich zu Proben embryonaler mHypoE
N25/2 und mHypoE N41-Zellen. Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (2 bis 6 unabhängige
Versuche, * bei p<0,05).
27
Ergebnisse
Die Produktion der für diese Studie relevanten Neuropeptide und Rezeptoren, die durch
den Nachweis der dafür notwendigen mRNA-Expression
mRNA
angenommen wird, lässt den
Schluss zu,, dass sich die mHypoA-2/23-Zellinie
mHypoA
Zellinie für die Untersuchung leptinabhängiger
und orexinabhängiger
bhängiger Genexpressionen eignet und ein geeignetes Modelsystem
Model
für
derartige
ge Untersuchungen darstellt.
darstellt
Zur Überprüfung der
er Spezifität von PCR-Produkten
PCR
wurden Agarosegelelektrophoresen
durchgeführt. Proben von murinem Hypothalamus (C57/B16-Mauslinie)
Mauslinie) dienten dabei als
Positivkontrolle.
500 Bp
100 Bp
M
NPY
AgRP
MCH
CRH
POMC
CART
OX1R
104
107
149
104
124
100
149
OX2R
LepR
TH
SF-1
PPO
ß-Actin
Actin
111
106
104
104
136
139
Bp
500 Bp
100 Bp
M
L
Bp
Abbildung 9: Agarosegelelektrophorese der mittels q-PCR
PCR amplifizierten cDNA-Fragmente.
cDNA
(Bande linksseitig: mHypoA 2/23, Bande rechtsseitig: muriner Hypothalamus, M: Marker,
Marke L:
Leerprobe, Bp: Basenpaare).
Die Spezifität der PCR-Produkte
Produkte bezüglich Neuropeptide Y (NPY), Agouti-related-peptide
Agouti
(AgRP) und Prepro-Orexin
rexin (PPO)
(PPO sowie der anorexigenen Peptide Corticotropin-releasing
Corticotropin
Hormone (CRH), Proopiomelanocortin (POMC) und Cocaine-and
and amphetamine-regulated
amphetamine
transcript
(CART)
konnte
ebenso
gesichert
werden
wie
die
der
für
die
Behandlungsstudien
lungsstudien notwendigen OX
O 1-, OX2- und Leptinrezeptoren.
Im Vergleich zur hypothalamischen Positivkontrolle konnte keine spezifische Bande für
Tyrosine hydroxylase (TH)-- und Splicing factor 1 (SF-1) in der neuronalen Zelllinie erkannt
werden (Abb. 9).. Dieses Ergebnis ist kongruent mit der fehlenden mRNA-Basalexpression
mRNA
dieser Peptide aus vorherigem Experiment. Die Präsenz der Banden im murinen
Hypothalamus sichert die Primer-Spezifität.
Primer
28
Ergebnisse
A
B
Abbildung 10: Schmelzkurvenanalyse amplifizierter cDNA von TH (A) und SF-1 (B)
Für das cDNA-Fragment des Melanin-concentrating hormone (MCH) aus Proben der
mHypoA-2/23-Zelllinie war darüber hinaus keine spezifische Bande bei 149 Basenpaaren
detektierbar. Weiterhin konnte ein Unterschied der Schmelzkurven von 1,8 °C zwischen
der amplifizierten DNA aus mHypoA-2/23-Zellen und murinem Hypothalamus festgestellt
werden (Abb. 11A). Die Analyse des MCH-Gens (Abb. 11B) lässt ein 253 Basenpaare
großes Intron im vom Primerpaar flankierten Genabschnitt erkennen, welches die Bande
von 402 Basenpaaren erklärt. Eine fehlende Bande bei 149 Basenpaaren im Agarosegel
und der fehlende zweite Peak der Schmelzkurve legen nahe, dass es sich bei der
amplifizierten DNA um das 402 Basenpaare große Antisense-Transkript handelt1, das für
das antisense-RNA-overlapping-MCH-gene (AROM) oder PARP1-bindendes Protein
(PARP1-BP) kodiert (Borsu et al., 2000). Damit exprimiert die mHypoA-2/23-Zelllinie kein
MCH.
A
B
Abbildung 11: Schmelzkurvenanalyse amplifizierter cDNA-Fragmente (A) und murines
1
MCH-Gen (B, vom Primerpaar flankierter Genabschnitt ist grau hinterlegt).
1
siehe NCBI Gene ID 110312 / Reference Sequence: NM_029971.2 (PMCH) und
Gene ID 75317 / NCBI Reference Sequence: NM_029249.2 (PARP1-BP), Nucleotide NC_000076.6
29
Ergebnisse
3.2
Beeinflussung
der
leptinregulierten
Genexpression
hypothalamischer Neuropeptide durch Orexine
Die Untersuchung des Einflusses von Orexin A und Orexin B auf die leptinregulierte
Genexpression von NPY, AgRP, CRH, POMC und dem MCH-antisense-transcript (im
Folgenden als AROM bezeichnet) stellt den Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit dar.
Für diese Experimente wurden Zellen in einer Konzentration von 2 x 105 Zellen/ml in einer
24 Well-Platte für 24 Stunden inkubiert und anschließend (ausgenommen der
Kontrollgruppe) mit 100 nM Leptin, 1 µM Orexin A bzw. Orexin B oder einer Kombination
aus einem der Orexine und Leptin stimuliert. Die Ergebnisse der Untersuchungen aus 4
Wells bildeten für die statistische Auswertung eine Behandlungsgruppe. Nach einer der
vordefinierten Zeitintervalle wurde der Versuch durch Zelllyse beendet. Für jeden
Zeitpunkt wurden auf diese Weise vier unabhängige Experimente durchgeführt. Der
Mittelwert einer Behandlungsgruppe ging als Ergebnis in die grafische Auswertung ein.
Dargestellt sind somit die Mittelwerte der sechs Behandlungsgruppen von vier
unabhängigen Versuchen. Die Genexpression der unbehandelten Zellpopulation stellte
dabei die relative Expression von 1 dar, gegen die die Ergebnisse der anderen
behandelten Gruppen berechnet wurden. Als interner Standard wurde die RNA-Menge
der jeweiligen Probe verwendet.
Untersucht werden sollte die Fragestellung, ob eine zusätzliche Stimulation der hier
verwendeten
Neurone
mit
Orexinen
die
leptinvermittelte
Genexpression
appetitregulierender hypothalamischer Peptide signifikant verändert.
Zur
Berechnung
eines
signifikanten
Unterschiedes
wurde
die
zweifaktorielle
Varianzanalyse verwendet (ggf. mit Bonferroni-Post-Hoc-Test), wobei der Einfluss der
zwei Variablen Leptin und Orexin A bzw. Orexin B auf die abhängige Variable
„Genexpression“ untersucht wurde.
Es wurde zweiseitig getestet mit einem gewählten Signifikanzniveau von α = 0,05.
Die Abbildungen zu den im Folgenden beschriebenen Ergebnissen befinden sich am
Ende dieses Kapitels 3.2.
30
Ergebnisse
NPY
Die Einzelstimulation von mHypoA-2/23-Neuronen mit 1 µM Orexin A oder 1 µM Orexin B
veränderte die Genexpression von NPY in einem Beobachtungszeitraum von 30 Minuten
bis 12 Stunden nicht. 100 nM Leptin ohne zusätzliche Gabe von Orexinen erhöhte die
NPY-mRNA signifikant nach einer
Stunde Behandlungszeit.
Nach 30-minütiger
Behandlung verfehlt dieser Effekt knapp das Signifikanzniveau. Drei-, sechs- und
zwölfstündige Stimulation der Zellen mit Leptin zeigt diesbezüglich keine signifikante
Veränderung bei insgesamt die NPY-mRNA leicht erhöhenden Tendenz.
Die kombinierte Inkubation der Zellen mit 100 nM Leptin und 1 µM Orexin A bzw. Orexin B
senkte nach 30 und 60 Minuten Behandlungszeit die Genexpression um ca. 29 – 42 %
gegenüber den nur mit Leptin behandelten Zellen (Abb. 12). Dieser Trend ist im gesamten
übrigen Beobachtungszeitraum ersichtlich, verfehlt jedoch das Signifikanzniveau. Es lässt
sich aufgrund der erhobenen Daten nicht erschließen, ob dieser auf die mRNAKonzentration regrediente Effekt durch Leptin oder Orexin A bzw. Orexin B selbst bedingt
ist oder eine signifikante Reduktion der mRNA-Konzentration durch eine Interaktion beider
Hormone verursacht ist. Die Neurone, die kombiniert behandelt wurden, wiesen keine
signifikant niedrigere NPY-mRNA-Konzentration im untersuchten Behandlungszeitraum
auf, als Neurone, die nur unter dem Einfluss der Orexine standen.
AgRP
Die Einzelstimulation mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B und 100 nM Leptin inhibierte die
Genexpression von AgRP nach 30 Minuten um ca. 30 % (Abb. 13). Die kombinierte Gabe
von 100 nM Leptin und Orexin B führte zu einem additiven Effekt und senkte die
Genexpression gegenüber dem Effekt der Einzelstimulation um weitere 15 %.
Selbiger Effekt kann für Orexin A angenommen werden, lässt sich bei gewählten
Signifikanzgrenzen hingegen nicht beweisen. Der Effekt von Orexin A und Orexin A +
Leptin auf die abhängige Variable unterscheidet sich nicht signifikant.
Nach einer Behandlungszeit von einer Stunde ist ein signifikanter Unterschied zwischen
der mit Leptin und der mit Leptin + Orexin B behandelten Gruppe erkennbar.
Überdies ergaben sich im übrigen Messzeitraum keine maßgeblichen Unterschiede
zwischen den behandelten Gruppen. Zudem war kein eindeutiger Trend ersichtlich.
31
Ergebnisse
POMC
Die Behandlung mit Orexin A führte im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe zu
einer
signifikanten
Reduktion
der
POMC-Genexpression
nach
30
Minuten
Stimulationszeit. Nach 30 Minuten, einer Stunde und drei Stunden Behandlungszeit
imponiert ein signifikanter Unterschied zwischen der mit Leptin behandelten Gruppe und
derjenigen, der eine Kombinationsbehandlung aus Leptin und Orexin B zugrunde liegt
(Abb. 14). Es lässt sich aufgrund der Daten nicht erschließen, ob dieser auf die mRNAKonzentration senkende Effekt durch Leptin oder Orexin B selbst bedingt ist oder eine
signifikante Reduktion der POMC mRNA-Konzentration um ca. 30 % durch eine
notwendige Interaktion beider Hormone verursacht ist.
CRH
Die Einzelstimulation mit 1 µM Orexin A inhibierte statistisch signifikant die Genexpression
von CRH nach 12 Stunden um 35 - 40 % (Abb. 15). Die kombinierten Stimulationen mit
Leptin
und
Orexinen
beeinflussten
die
mRNA-Menge
von
CRH
im
übrigen
Beobachtungszeitraum nicht in signifikanter Weise.
AROM
Ähnlich den erhobenen Befunden für die Regulation von POMC zeigt sich ein signifikanter
Unterschied zwischen der mit Leptin und der mit Leptin und Orexin B behandelten Gruppe
nach 1 Stunde sowie bezüglich Orexin B vs. Orexin B + Leptin
nach 3 Stunden
Behandlungszeit. Die kombinierten Stimulationen führen zu einer Reduktion der mRNA
um 20 - 30 % (Abb. 16). Es lässt sich aufgrund der erhobenen Daten auch hier nicht
eruieren, ob dieser auf die mRNA-Konzentration regrediente Effekt durch Leptin oder
Orexin B selbst bedingt ist oder eine signifikante Reduktion der AROM mRNAKonzentration durch eine Interaktion beider Hormone ausgelöst wird.
32
Ergebnisse
15 Minuten
30 Minuten
*
**
1.5
relative NPY- Expression
relative NPY- Expression
1.5
1.0
0.5
0.0
1.0
0.5
0.0
-
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3 Stunden
1 Stunde
*
**
1.5
***
relative NPY- Expression
relative NPY- Expression
1.5
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
1.0
0.5
0.0
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
1.5
relative NPY- Expression
1.5
relative NPY- Expression
+
-
12 Stunden
6 Stunden
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
-
1.0
0.5
0.0
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
Abbildung 12: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von NPY nach
verschiedenen Behandlungszeiträumen. mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher
Konzentration behandelt. Anschließend erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR.
Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (4 unabhängige Experimente; * bei p <0.05, ** bei
p <0.01, *** bei p <0.001).
33
Ergebnisse
15 Minuten
30 Minuten
1.5
relative AgRP- Expression
relative AgRP- Expression
1.5
***
***
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
-
Leptin (100 nM)
+
-
+
-
+
+
+
+
+
**
*
*
*
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
-
Leptin (100 nM)
+
-
1 Stunde
relative AgRP- Expression
relative AgRP- Expression
+
+
+
+
+
+
+
+
1.5
**
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
-
Leptin (100 nM)
+
-
+
-
+
+
+
+
+
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
-
Leptin (100 nM)
+
-
+
-
+
12 Stunden
6 Stunden
1.5
relative AgRP- Expression
1.5
relative AgRP- Expression
+
3 Stunden
1.5
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
-
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Abbildung 13: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von AgRP nach
verschiedenen Behandlungszeiträumen. mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher
Konzentration behandelt. Anschließend erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR.
Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (4 unabhängige Experimente; * bei p <0.05, ** bei
p <0.01, *** bei p <0.001).
34
Ergebnisse
30 Minuten
relative POMC- Expression
relative POMC- Expression
15 Minuten
1.5
1.0
0.5
*
*
1.0
0.5
0.0
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
1.5
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
*
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1.5
*
1.0
0.5
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
12 Stunden
6 Stunden
relative POMC- Expression
relative POMC- Expression
+
+
0.0
-
1.5
1.0
0.5
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
3 Stunden
1.5
relative POMC- Expression
relative POMC- Expression
1 Stunde
+
-
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
Abbildung 14: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von POMC nach
verschiedenen Behandlungszeiträumen. mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher
Konzentration behandelt. Anschließend erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR.
Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (4 unabhängige Experimente, * bei p <0.05).
35
Ergebnisse
30 Minuten
15 Minuten
relative CRH- Expression
relative CRH- Expression
2.0
2.0
1.5
1.0
0.5
1.0
0.5
0.0
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
1.5
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
relative CRH- Expression
relative CRH- Expression
1.0
0.5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
6 Stunden
+
-
+
12 Stunden
2.0
2.0
relative CRH- Expression
relative CRH- Expression
+
+
2.0
1.5
1.5
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
3 Stunden
1 Stunde
2.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
+
-
*
1.5
*
1.0
0.5
0.0
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
Abbildung 15: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression von CRH nach
verschiedenen Behandlungszeiträumen. mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher
Konzentration behandelt. Anschließend erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR.
Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (4 unabhängige Experimente; * bei p <0.05).
36
Ergebnisse
30 Minuten
15 Minuten
1.5
relative AROM- Expression
relative AROM- Expression
1.5
1.0
0.5
0.0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
1.0
0.5
0.0
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
1 Stunde
relative AROM- Expression
relative AROM- Expression
1.5
*
1.0
0.5
0.0
Leptin (100 nM)
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1.0
0.5
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
12 Stunden
1.5
relative AROM- Expression
relative AROM- Expression
+
+
0.0
-
1.5
1.0
0.5
1.0
0.5
0.0
0.0
Leptin (100 nM)
+
+
*
6 Stunden
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
+
3 Stunden
1.5
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
+
-
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
-
+
-
+
Abbildung 16: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression des AROM nach
verschiedenen Behandlungszeiträumen. mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher
Konzentration behandelt. Anschließend erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR.
Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (4 unabhängige Experimente, * bei p <0.05).
37
Ergebnisse
3.3
Einfluss von Orexinen und Leptin auf die Genexpression der
Orexinrezeptoren
Da bereits gezeigt werden konnte, dass Orexin A in der Nebenniere die mRNAExpression des OX2-Rezeptors nach 6, 12 und 24 Stunden senkt (Wenzel et al., 2009),
sollte diese Modulation auch in den mHypoA-2/23-Neuronen untersucht werden. Die
stärkste Inhibition wurde in den NCI-Zellen der Nebenniere nach 12 Stunden erreicht.
Eine Veränderung der Rezeptordichte an der Zelloberfläche könnte eine Erklärung für
zeitlich unterschiedliche Effekte von Orexinen und Leptin sein.
Im ersten Teil des Experimentes wurde die mRNA-Menge des OX2-Rezeptors nach 12
Stunden
Behandlungszeit
untersucht.
Dabei
konnte
keine
Veränderung
der
Genexpression durch Orexin A, Orexin B, Leptin oder Kombinationen von Leptin und
Orexinen nachgewiesen werden (Abb. 17). Experimente mit 30 Minuten, 1 Stunde, 3
Stunden und 6 Stunden Behandlungsdauer erbrachten ebenfalls keine signifikante
Beeinflussung der OX2-Rezeptor-Genexpression.
Anschließend sollte zum Vergleich auch die mRNA des OX1-Rezeptors untersucht
werden. Unter gleichen Versuchsbedingungen und Behandlungszeiträumen konnte auch
hier keine signifikante Veränderung der OX1-Genexpression durch Leptin oder
Orexinstimulation aufgezeigt werden.
Die durch Orexine ausgelösten Effekte (in Kapitel 3.2 dargelegt) sind somit nicht durch
eine
Veränderung
der
Orexinrezeptor-mRNA-Produktion
und
damit
verbundener
Änderung der zellulären Reaktion auf Orexine erklärbar.
38
Ergebnisse
A
Dauer der Stimulation:
0,5 h
1h
3h
6h
12 h
relative OX1R-Expression
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1 µM Orexin A
1 µM Orexin B
0,1 µM Leptin
B
1 µM Orexin A 1 µM Orexin B
+ 0,1 µM Leptin + 0,1 µM Leptin
Dauer der Stimulation:
0,5 h
1h
3h
6h
12 h
relative OX2R-Expression
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1 µM Orexin A
1 µM Orexin B
0,1 µM Leptin
1 µM Orexin A 1 µM Orexin B
+ 0,1 µM Leptin + 0,1 µM Leptin
Abbildung 17: Einfluss der Orexine und Leptin auf die mRNA-Expression des OX1- (A) und
des OX2-Rezeptors (B) nach verschiedenen Behandlungszeiträumen.
mHypoA-2/23-Neurone wurden entweder mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin
und mit Kombinationen dieser Substanzen in gleicher Konzentration behandelt. Anschließend
erfolgte die quantitative mRNA-Bestimmung mit q-PCR. Daten sind dargestellt als Mittelwerte ±
SEM (3 - 4 unabhängige Experimente).
39
Ergebnisse
3.4
Die posttranskriptionelle Modifikation der mRNA von NPY,
AgRP und AROM
Die unmittelbare Reduktion der AgRP-mRNA nach 30 Minuten durch Orexine und Leptin
warf die Frage nach einer transkriptionellen oder posttranskriptionellen Regulation auf.
Zur Beantwortung dieser Frage wurde ein Versuchsaufbau zur Messung der mRNAStabilität etabliert. Eine chronische Inkubation mit Actinomycin D in einer Konzentration
von 0,5 µg/ml hemmte während des Versuchs die DNA-abhängige RNA-Synthese. Da in
den Versuchen zur Beeinflussung der Genexpression (Kapitel 3.2) der Unterschied
zwischen unbehandelten Zellen und kombiniert stimulierten Zellen (100 nM Leptin und
1 µM Orexin A bzw. Orexin B) am größten war, wurde zunächst ein Experiment über 2
Stunden mit diesen Behandlungsgruppen durchgeführt, um etwaige Effekte zu erfassen.
Als stabiler interner Standard wurde ß-Actin verwendet. Die Anzahl der mRNA-Kopien zu
Untersuchungsbeginn wurde = 100 % gesetzt und die Kopienanzahl zu späteren
Versuchszeitpunkten im Verhältnis hierzu berechnet. Unter Verwendung der Mittelwerte
aus drei unabhängigen Versuchen erfolgte eine lineare Regression mit Erstellung einer
Regressionsgeraden bei halblogarithmischer Darstellung der Messwerte. Die ermittelten
Steigungen der Geraden entsprechen somit der Zerfallskonstante. Geprüft wurde
abschließend, ob sich diese signifikant voneinander unterscheiden.
Die Inkubation mit Leptin und Orexin A bzw. Orexin B führte zu keiner signifikanten
Abnahme der mRNA-Menge von AgRP gegenüber unbehandelten Zellen nach 30
Minuten, einer Stunde oder zwei Stunden Behandlungszeit (Abb. 18 A). Nach zwei
Stunden sind noch ca. 50 % der Ausgangs-mRNA vorhanden, unabhängig von der
hormonellen Stimulation der Zellen. Dieser Versuch erbrachte damit keine Hinweise auf
eine posttranskriptionelle Regulation von AgRP in mHypoA-2/23-Zellen.
Anschließend wurde untersucht, ob die mRNA von Neuropeptid Y oder AROM
posttranskriptionell modifiziert wird. Bei 3 unabhängigen Versuchen zeigte sich keine
statistische signifikante Veränderung der mRNA-Stabilität durch Einzelstimulation oder
kombinierte Stimulationen mit Leptin, Orexin A und Orexin B (Abb. 18 B).
Abschließend wurde der Versuchsaufbau für die Untersuchung des AROM verwendet, um
dessen Einfluss in der neuronalen Zelllinie weiter zu charakterisieren. Es konnte gezeigt
werden, dass sich deren mRNA-Menge im untersuchten Zeitraum von 2 Stunden durch
die kombinierte Inkubation der Zellen mit Leptin und Orexin A bzw. Orexin B nicht
beeinflussen lässt (Abb. 18 C).
Damit konnte gezeigt werden, dass der Einfluss des Leptins und der Orexine auf die
mRNA
des
AgRP
unter
gewählten
Versuchsbedingungen
nicht
durch
eine
posttranskriptionelle Modifikation erklärt werden kann. Gleiche Ergebnisse wurden für die
40
Ergebnisse
Regulation des NPY erzielt. Im Hinblick auf die weitere Charakterisierung des AROM
konnte nachgewiesen werden, dass im beobachteten Zeitraum ebenfalls keine
posttranskriptionelle Beeinflussung der mRNA durch Orexine und Leptin zu erreichen war.
AgRP-mRNA-Kopien [%]
A
100.0
10.0
Kontrolle
Leptin+ Orexin A
Leptin+ Orexin B
1.0
0
NPY-mRNA-Kopien [%]
30
60
90
120
Behandlungszeit in Minuten
B
100.0
10.0
Kontrolle
Leptin+ Orexin A
Leptin+ Orexin B
1.0
0
60
90
120
Behandlungszeit in Minuten
C
AROM-mRNA-Kopien [%]
30
100.0
10.0
Kontrolle
Leptin+ Orexin A
Leptin+ Orexin B
1.0
0
30
60
90
120
Behandlungszeit in Minuten
Abbildung 18: mRNA-Stabilität von AgRP, NPY und AROM in mHypoA-2/23-Neuronen unter
Hemmung der Transkription mit Actinomycin D und Behandlung mit Orexinen und Leptin
mHypoA-2/23-Neurone wurden unter Transkriptionshemmung mit Actinomycin D (0,5 µg/ml) mit
1 µM Orexin A + 100 nM Leptin oder 1 µM Orexin B + 100 nM Leptin behandelt und nach 30, 60
und 120 min. lysiert (A, B, C). Als interner Standard wurde ß-Actin verwendet. Die mRNA der
Kontrollgruppe bei Behandlungsbeginn wurde auf die Gesamt-mRNA normiert und = 100 %
gesetzt. Der prozentuale Abbau der mRNA ist als Regressionsgerade dargestellt, basierend auf
Mittelwerten ± SEM aus 3 unabhängigen Experimenten.
41
Ergebnisse
3.5
Untersuchung intrazellulärer Signalkaskaden
3.5.1 Die Beeinflussung der intrazellulären Ca2+-Konzentration
Nachdem gezeigt werden konnte, dass Orexine die Genexpression hypothalamischer
Peptide direkt und in Kombination mit Leptin beeinflussen können, stellte sich die Frage
nach deren Interaktion auf der Ebene intrazellulärer Signaltransduktion.
Zur Beantwortung dieser Frage sollte zunächst ein potentieller Effekt auf die intrazelluläre
Ca2+-Freisetzung
untersucht
werden.
Als
Positivkontrolle
wurden
humane
Nebennierenrindenzellen (NCI-H295R) verwendet, in denen eine Erhöhung intrazellulärer
Ca2+-Konzentrationen auf Orexinstimulationen bereits beschrieben wurde (Wenzel et al.,
2009). In beiden Zelllinien diente das Ionophor Ionomycin als Nachweis der methodischen
Funktionalität, da dieses Molekül primär intrazelluläre, gespeicherte Ca2+-Ionen freisetzt
(Morgan und Jacob, 1994).
Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Zelllinie mHypoA-2/23, als auch die NCIH295R-Zellen mit einer intrazellulären Ca2+-Konzentrationserhöhung auf die Gabe von 5
µM Ionomycin oder 50 bzw. 500 mM KCl reagierten (KCl-Effekte aus Übersichtsgründen
nicht gezeigt). Die Stimulation mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B bzw. 100 nM Leptin
führte ebenso zu einer Zunahme der intrazellulären Ca2+-Konzentration in beiden
Zelllinien (Abb. 19). Bei insgesamt drei durchgeführten Versuchen waren die
Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen nicht signifikant, mit Ausnahme der
Stimulation durch Ionomycin in NCI-Neuronen. Bei deutlich sichtbaren Trends werden hier
weitere Versuche mutmaßlich signifikante Unterschiede aufzeigen.
Da sowohl Orexin A, als auch Orexin B und Leptin eine Erhöhung der Ca2+-Konzentration
im Zellinneren bewirken, sollte im Folgenden eine Dosis-Wirkungskurve für diese 3
Substanzen erstellt werden. Zusätzlich war es das Ziel, den Effekt einer kombinierten
Orexin- und Leptingabe zu untersuchen.
Dabei zeigte sich ein im Trend additiver Effekt von Leptin und Orexin A bzw. B auf die
Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration (Abb. 20). Die EC50-Werte unterschieden
sich nicht wesentlich zwischen der Orexin- und der Leptin + Orexin-Behandlungsgruppe.
Das Ionophor Ionomycin wurde als interne Positivkontrolle verwendet. In einer
Konzentration von 5 µM führte es zu einer etwa 2,5-fach höheren intrazellulären Ca2+Freisetzung im Vergleich zum Maximum, welches durch Orexin A oder B erreichbar war.
Bei drei erfolgten Versuchen fallen die erfassten Unterschiede noch nicht signifikant aus.
42
Ergebnisse
mHypoA- 2/23- Neurone
A
8000
∆Fluoreszenz
6000
4000
2000
0
Zeit [s]
-2000
20
40
B
60
80
100
120
NCI- Neurone
8000
∆Fluoreszenz
6000
4000
2000
0
Zeit [s]
-2000
20
40
60
80
Kontrolle
Orexin A (1 µM)
Ionomycin (5 µM)
Orexin B (1 µM)
Kontrolle vs. Orexin A
vs. Orexin B
vs. Leptin
vs. Ionomycin
100
120
Leptin (0,1 µM)
NCI-Neurone  mHypoA-2/23-Neurone
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
* (>25 s)
2+
Abbildung 19: Veränderungen intrazellulärer Ca -Konzentrationen durch Orexine und
Leptin in mHypoA-2/23-(A) und NCI-H295R-Zellen (B)
A) mHypoA-2/23-Neurone wurden nach 20 Sekunden Vorlauf mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B,
2+
100 nM Leptin oder 5 µM Ionomycin stimuliert und die Zunahme des zytosolischen Ca über die
Fluo-4-Fluoreszenz bestimmt. B) NCI-Zellen dienten als Positivkontrolle. Dargestellt sind die
Mittelwerte von 3 unabhängigen Versuchen; ns = nicht signifikant, * bei p <0.05.
43
Ergebnisse
A
Ca 2+- Erhöhung
% of Orexin Am ax
200
Leptin
Orexin A
Leptin + Orexin A
additive Kurve
150
100
50
EC50 (Orexin A) :
9,35 x 10 -6 M
EC50 (Leptin) :
5,25 x 10 -6 M
EC50 (Leptin+Orexin A) : 8,99 x 10 -6 M
0
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
Ionomycin5 µM in % von Orexin A max: ∅ 225%
Orexin A (M)
_______________________
'
'
10' -9
10' -8
10' -7
Leptin (M)
B
Ca2+- Erhöhung
% of Orexin B m a x
200
Leptin
Orexin B
Leptin + Orexin B
additive Kurve
150
100
50
EC50 (Orexin B) :
6,10 x 10 -7 M
EC50 (Leptin) :
1,28 x 10 -7 M
EC50 (Leptin+Orexin B) : 4,50 x 10 -7 M
0
10 -8
10 -7
10 -6
Orexin B (M)
_______________________
'
'
10' -9
10' -8
10' -7
10 -5
Ionomycin5 µM in % von Orexin B max: ∅ 262%
Leptin (M)
Abbildung 20: Dosiswirkungskurven für Orexine, Leptin und deren Kombinationen
mHypoA-2/23-Neurone wurden in verschiedenen Konzentrationen mit Orexin A (A) bzw. Orexin B
2+
(B), Leptin und deren Kombinationen behandelt und die Erhöhung des intrazellulären Ca über die
Fluo-4-Fluoreszenz bestimmt. Analysiert wurde der maximale Anstieg der Fluoreszenz gegenüber
der Basalrate. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (3 unabhängige Versuche; additive Kurve
summiert Werte von Orexin A bzw. Orexin B und Leptin).
44
Ergebnisse
3.5.2 Die Aktivierung der ERK 1/2 (p44/42 MAPK)
Als weiterer intrazellulärer Signalweg wurde der MAP-Kinase-Signalweg untersucht. In
anderen mHypo-Neuronen sind sie ebenfalls an der Regulierung von NPY und auch
AgRP beteiligt (Dhillon und Belsham, 2011; Mayer und Belsham, 2009).
Die neuronalen mHypoA-2/23-Zellen zeigten nach Stimulation mit 1 µM Orexin A,
1 µM Orexin B oder 100 nM Leptin für 15 Minuten keine signifikante Phosphorylierung der
ERK 1/2 (p44/42 MAPK). Als interner Standard wurde ß-Tubulin (55 kDa) verwendet, da
sich die Banden von ß-Actin (42 kDa) mit denen der MAP-Kinasen überlagert hätten. Der
gewählte Behandlungszeitraum von 15 Minuten wurde analog des methodischen
Vorgehens in den eben zitierten Veröffentlichungen gewählt.
ß-Tubulin
p-ERK 1/2
ERK 1/2
ERK-1/2Phosphorylierung
[in % des Basalwertes]
150
100
50
0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
Abbildung 21: Regulation von ERK 1/2 in mHypoA-2/23-Zellen durch Orexine und Leptin. Ein
repräsentativer Western Blot zeigt die Expression der phosphorylierten ERK 1/2 (p-ERK 1/2) und
der ERK 1/2-Gesamtform. Eine quantitative Analyse der p-ERK 1/2 bezogen auf die ERK-1/2Gesamtform erfolgte mit ImageJ. Zellen wurden für 15 min. mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B, oder
100 nM Leptin und Kombinationen der Substanzen behandelt und anschließend lysiert. Gleiche
Proteinmengen sind aufgetragen worden und mit der Expression des ß-Tubulins kontrolliert. Daten
sind als Mittelwerte dargestellt ± SEM (3 unabhängige Experimente).
45
Ergebnisse
3.5.3 Die Aktivierung der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-2 und deren
Einfluss auf ERK 1/2 (p44/42 MAPK)
Eine gezielte Deletion der SHP-2 in Neuronen begünstigt die Entwicklung eines
metabolischen Syndroms (Banno et al., 2010; Krajewska et al., 2008; Zhang et al., 2004)
und eine Regulation von SHP-2 über Aktivierung des Leptinrezeptors oder der
Orexinrezeptoren ist gut belegt (Banks et al., 2000; Bjorbaek et al., 2001; Laburthe und
Voisin, 2012; Li und Friedman, 1999; Morton und Schwartz, 2011). Daher wurden die
mHypoA-2/23-Neurone dahingehend untersucht, ob eine Einzel- bzw. Costimulation mit
Leptin und Orexinen zu signifikanter Phosphorylierung der SHP-2 führt. Zwei
Phosphorylierungsstellen kommen hierfür in Betracht, Tyr-542 und Tyr-580.
ß-Actin
p-SHP-2 (Y542)
SHP-2
p-SHP-2 (Y542)Phosphorylierung
[in % des Basalwertes]
200
150
100
50
0
Orexin A (1 µM)
Orexin B (1 µM)
Leptin (100 nM)
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
Abbildung 22: Phosphorylierung von SHP-2 an Position Tyr-542 durch Orexin A, Orexin B
und Leptin in mHypoA-2/23-Zellen. Ein repräsentativer Western Blot zeigt die Expression der an
Tyr-542 phosphorylierten SHP-2 (p-SHP-2). Eine quantitative Analyse der p-SHP-2 (Y542)
bezogen auf die SHP-2-Gesamtform erfolgte mit ImageJ. Zellen wurden für 15 min mit 1 µM Orexin
A, 1 µM Orexin B, oder 100 nM Leptin und Kombinationen der Substanzen behandelt und
anschließend lysiert. Gleiche Proteinmengen sind aufgetragen worden und mit der Expression des
ß-Actins kontrolliert. Daten sind als Mittelwerte dargestellt ± SEM (3 unabhängige Experimente).
46
Ergebnisse
Die Einzelstimulation mit Leptin führt zu keiner Änderung der SHP-2-Phosphorylierung am
Tyrosinrest 542 und 580. Unter dem Einfluss von Orexin A oder Orexin B kam es zu einer
Reduktion um 35 - 40 % (Tyr-542); der Tyrosinrest 580 blieb unverändert. Diese Reduktion
verfehlt nach drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen das für diese
Versuchsreihe vorher festgelegte Signifikanzniveau.
Die
Costimulation
mit
Leptin
führte
zu
keiner
signifikanten
Änderung
des
Phosphorylierungsstatus gegenüber den Versuchsgruppen, die mit Orexin A oder Orexin
B behandelt wurden. Diese Aussage gilt für beide SHP-2-Phosphorylierungsstellen (Abb.
22 und 23). Dieser Versuchsaufbau lässt eine Reduktion der SHP-2-Phosphorylierung an
der Position Tyr-542 durch Orexine vermuten. Diese Aussage muss durch weitere
Versuche belegt werden.
ß-Actin
p-SHP-2 (Y580)
SHP-2
p-SHP-2 (Y580)Phosphorylierung
[in % des Basalwertes]
200
150
100
50
0
Orexin A (1µM)
Orexin B (1µM)
Leptin (100nM)
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
Abbildung 23: Phosphorylierung von SHP-2 an Position Tyr-580 durch Orexin A, Orexin B
und Leptin in mHypoA-2/23-Zellen. Ein repräsentativer Western Blot zeigt die Expression der an
Tyr-580 phosphorylierten SHP-2 (p-SHP-2). Eine quantitative Analyse der p-SHP-2 (Y580)
bezogen auf die SHP-2-Gesamtform erfolgte mit ImageJ. Zellen wurden für 15 min. mit 1 µM
Orexin A, 1 µM Orexin B, oder 100 nM Leptin und Kombinationen der Substanzen behandelt und
anschließend lysiert. Gleiche Proteinmengen sind aufgetragen worden und mit der Expression des
ß-Actins kontrolliert. Daten sind als Mittelwerte dargestellt ± SEM (3 unabhängige Experimente).
47
Ergebnisse
Eine SHP-2-vermittelte Aktivierung von ERK 1/2 über MEK1 ist bereits gezeigt worden
(Banks et al., 2000; Bjorbaek et al., 2001; Li und Friedman, 1999; Morton und Schwartz,
2011). Gegenstand der abschließenden Untersuchung war die Abhängigkeit der ERK-1/2Phosphorylierung von vorheriger Hemmung der SHP-2. Es konnte nachgewiesen werden,
dass die Gabe des SHP-Inhibitors NSC 87877 30 Minuten vor der 15-minütigen Orexinund Leptingabe den Phosphorylierungsstatus von ERK 1/2 in mHypoA-2/23-Zellen nicht
signifikant beeinflusst.
ß-Tubulin
p-Erk 1/2
Erk 1/2
Erk-1/2Phosphorylierung
[in % des Basalwertes]
250
200
150
100
50
0
Orexin A
(1 µM)
Orexin B
(1 µM)
Leptin
(100 nM)
NSC 87877 (20 µM)
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Abbildung 24: Abhängigkeit der ERK-1/2-Phosphorylierung von Orexin- und
Leptinstimulation unter Inhibition von SHP-2 in mHypoA-2/23-Neuronen. Ein repräsentativer
Western Blot zeigt die Expression von phospho-ERK 1/2 (p-ERK 1/2) und der ERK-1/2Gesamtform. Eine quantitative Analyse der p-ERK 1/2 bezogen auf die ERK-1/2-Gesamtform
erfolgte mit ImageJ. Zellen wurden für 15 min mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B, oder 100 nM
Leptin und Kombinationen der Substanzen behandelt und anschließend lysiert. Die SHP-2Hemmung mit NSC 87877 erfolgte 30 min vor der Orexin- und/oder Leptingabe. Daten sind als
Mittelwerte dargestellt ± SEM (3 unabhängige Experimente).
48
Ergebnisse
3.5.4 Die Regulation des Transkriptionsfaktors STAT3
Nukleinsäuren (Dapi)
p-STAT3 (Tyr-705)
kombiniertes Bild
Kontrolle
Leptin
(100nM)
Orexin A
(1 µM)
Orexin B
(1 µM)
Leptin +
Orexin A
(100 nM,
1 µM)
Leptin +
Orexin B
(100 nM,
1 µM)
Abbildung 25: Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors
Transkriptionsfaktors STAT3 durch Leptin (100
(
nM),
Orexin A (1 µM), Orexin B (1 µM) und deren Kombinationen. mHypoA-2/23
2/23-Neurone wurden für
15 min. wie angegeben behandelt. Die Färbung der Nukleinsäuren erfolgte mit Dapi (blau), pSTAT3 (Tyr-705)
705) ist grün dargestellt. Abgebildet sind die zusammenhängenden Aufnahmen eines
Versuches im konfokalen Lasermikroskop.
Lase
49
Ergebnisse
Eine 15-minütige Stimulation mit 0,1 µM Leptin führte zu einer STAT3-Phosphorylierung
und ist vereinbar mit Ergebnissen in ähnlichen Zelllinien (Dalvi et al., 2012). Detektiert
wurde diese durch eine konfokale Immunfluoreszenz-Analyse. Orexin A und Orexin B
phosphorylierten das STAT3 nicht. Dieser Versuch zeigt die STAT3-Phosphorylierung
durch Bindung des Leptins am Leptinrezeptor, während weder Orexin A noch Orexin B bei
verwendeter Konzentration und Behandlungszeit einen ersichtlichen Einfluss auf diesen
Signalweg nimmt.
50
4.
Diskussion
Funato et al. konnten im Jahr 2009 zeigen, dass eine transgene Überexpression von
Orexinen bei Mäusen zu einer Förderung des Energieverbrauches und einer Verringerung
der Nahrungsaufnahme führt sowie zu einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber
der
Entwicklung
hochkalorischer,
ernährungsbedingter
Fettleibigkeit
und
Insulinunempfindlichkeit. Hierfür erforderlich ist die Funktionalität der durch Leptin
aktivierten intrazellulären Signalwege (Funato et al., 2009).
Eine Untersuchung der diesen Effekten zugrunde liegenden intrazellulären Mechanismen
der Interaktion zwischen Leptin und Orexinen erfolgte bislang nicht.
Dies stellte das Ziel der vorliegenden Arbeit dar.
Hierfür wurde zunächst ein geeignetes Modellsystem etabliert und charakterisiert.
4.1
Charakterisierung und Etablierung einer neuen Zelllinie:
murine, hypothalamische mHypoA-2/23-Neurone
Zur Untersuchung potentieller, intrazellulärer Interaktionen zwischen orexin- und
leptinabhängiger Signaltransduktion wurde eine Zelllinie gesucht, die in adäquater Menge
sowohl die die Energiehomöostase regulierenden Neuropeptide herstellt, als auch
ausreichende Mengen der Orexin- und Leptinrezeptoren exprimiert. Dafür wurde die
mRNA-Basalexpression von zwei embryonalen Zelllinien (mHypoE-N25/2 und mHypoEN41) sowie der adulten Zelllinie mHypoA-2/23 mittels q-PCR quantifiziert. Diese
Neuronen wurden durch Immortalisation muriner hypothalamischer Primärkulturen
gewonnen und aufgrund ihres spezifisches Expressionsmusters ausgewählt (Belsham et
al., 2004; Belsham et al., 2009).
Es konnte eine signifikant höhere Expression der Orexin- und Leptinrezeptoren in den
adulten gegenüber den embryonalen Neuronen gemessen werden. OX2-Rezeptoren
werden stärker als OX1-Rezeptoren exprimiert, wie es auch in den Proben aus dem
murinen Hypothalamus nachzuweisen war. Daher wurde die mRNA-Expression in der
adulten Zelllinie mHypoA-2/23 weiter quantifiziert und eine adäquate Genexpression von
Neuropeptid Y (NPY), Agouti-related peptide (AgRP), Corticotropin-releasing hormone
(CRH) und in geringerer Menge auch Proopiomelanocortin (POMC), Cocaine-and
amphetamine-regulated transcript (CART) und Prepro-Orexin (PPO) gemessen.
Diese Zelllinie stellt im Vergleich zu Proben aus dem murinen Hypothalamus keine
biologisch relevanten Mengen an Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Steroidogenic factor 1
51
Diskussion
(SF-1) her. Der Nachweis einer signifikanten Genexpression von mRNA orexigener und
anorexigener Peptide, als auch der Orexin- und Leptinrezeptoren führten zu der
Erkenntnis, dass sich die mHypoA-2/23-Zelllinie als geeignetes Modellsystem erweist, um
Interaktionen zwischen Orexinen und Leptin zu untersuchen.
4.2
Interaktion von Orexinen und Leptin und deren Einfluss auf
die Genexpression und Signaltransduktion
NPY
Das Neuropeptid Y (NPY) kommt im Hypothalamus, im Cortex, im Hippocampus sowie
dem Rhombencephalon vor (Chronwall et al., 1985; Tatemoto et al., 1982). Eine
spezifische Deletion von Leptinrezeptoren führt zu einer Erhöhung der NPYGenexpression und fördert damit die Entstehung eines metabolischen Syndroms (Cohen
et al., 2001), während eine spezifische Leptinrezeptor-Gentherapie im Nucleus arcuatus
sowohl die NPY-mRNA-Expression als auch die Fettleibigkeit bei Koletsky (fa(k)/fa(k))Ratten reduziert (Morton et al., 2003). Dies unterstreicht die Bedeutung der
Leptinrezeptoren bei der Regulation des Neuropeptid Y. Diese NPY-Neurone im Nucleus
arcuatus sind mit Neuronen im lateralen Hypothalamus verknüpft, die Orexine exprimieren
(Horvath et al., 1999). An deren Zelloberfläche finden sich sowohl Orexin- als auch
Leptinrezeptoren (Funahashi et al., 2003). Somit können Orexine, Leptin und NPY im
Gehirn interagieren und gemeinsam eine bedeutende Rolle in der zentralen Regulation
der Energiehomöostase übernehmen (Niimi et al., 2001).
Die Untersuchungen dieser Arbeit weisen erstmals intrazelluläre Interaktionen zwischen
leptin- und orexinvermittelter Signaltransduktion mit signifikanter Beeinflussung der NPYGenexpression
nach.
Der
genaue
Mechanismus
bleibt
Gegenstand
weiterer
Untersuchungen. Die kombinierte Inkubation der Zellen mit 100 nM Leptin und 1 µM
Orexin A bzw. Orexin B senkte nach 30 und 60 Minuten Behandlungszeit die
Genexpression um ca. 29 - 42 % gegenüber den nur mit Leptin behandelten Zellen.
Dieser Trend ist im gesamten übrigen Beobachtungszeitraum ersichtlich, verfehlt jedoch
das Signifikanzniveau. Es lässt sich aufgrund der erhobenen Daten nicht erschließen, ob
dieser auf die mRNA-Konzentration regrediente Effekt durch Leptin oder Orexin A bzw.
Orexin B selbst bedingt ist oder eine signifikante Reduktion der mRNA-Konzentration
durch eine Interaktion beider Hormone verursacht ist. Die Neurone, die kombiniert
behandelt wurden, wiesen keine signifikant niedrigere NPY-mRNA-Konzentration im
untersuchten Behandlungszeitraum auf, als Neurone, die nur unter dem Einfluss der
52
Diskussion
Orexine standen. Leptin konnte die NPY-mRNA nach einer Stunde signifikant erhöhen.
Dieser Trend ist auch in den anderen Untersuchungszeiträumen erkennbar, aber nicht
statistisch signifikant. Durch Hemmung der DNA-abhängigen RNA-Synthese mit
Actinomycin gelang eine Untersuchung potentieller posttranskriptioneller NPY-mRNAModifikation
durch
Leptin
in
Kombination mit
einem
der
Orexine.
In
einem
Untersuchungszeitraum von 2 Stunden beeinflussten diese Hormone die mRNA unter
Hemmung der Transkription nicht. Es ist bereits belegt, dass NPY sowohl transkriptionell
als auch posttranskriptionell in den neuronalen Zelllinien LA-N-5 und PC12 durch TPA
(tetradecanoyl phorbol-13-acetate) und Forskolin beeinflusst wird (Lerchen et al., 1995).
Daten zum Einfluss von Orexinen und Leptin auf die mRNA-Stabilität von NPY liegen
bislang nicht vor. Die Beeinflussung der mRNA-Stabilität könnte eine wichtige Rolle in der
Steuerung der Energiehomöostase einnehmen. Viele Neurotransmitter, die derart reguliert
werden, weisen die Sequenzwiederholungen ‘AUUUA‘ am 3‘-Ende auf (3‘-UTR) (Day und
Tuite, 1998). Die publizierten Gensequenzen von NPY hingegen weisen diese
beschriebene Sequenz nicht auf (Good, 2000).
Weiterhin wurde in der vorliegenden Studie die intrazelluläre Signaltransduktion
untersucht, um molekulare Interaktionen zwischen Orexinen und Leptin in dieser Hinsicht
zu analysieren.
Abbildung 26: Versuchsmodell potentieller synergistischer
Regulation der NPY-Genexpression in mHypoA-2/23-Neuronen.
Signaltransduktion
zur
53
Diskussion
Untersuchungsziel war die Überprüfung der Hypothese, dass die orexinvermittelten
aktivierten intrazellulären Botenstoffe mit der leptinabhängig aktivierten SHP-2 über den
MAP-Kinase-Signalweg die NPY-Genexpression beeinflussen (siehe Abb. 26).
Es wurde zunächst der MAP-Kinase-Signalweg untersucht. In anderen immortalisierten
hypothalamischen Neuronen ist er an der Regulation von NPY und auch AgRP beteiligt
(Dhillon und Belsham, 2011; Mayer und Belsham, 2009).
Die Phosphorylierung der ERK 1/2 nach Stimulation beider Orexinrezeptoren ist bereits
beschrieben, sowohl über die Proteinkinase C (PKC), Proteinkinase A als auch
Phospholipase C (PLC) (Ammoun et al., 2006; Milasta et al., 2005; Ramanjaneya et al.,
2009; Sasson et al., 2006; Tang et al., 2008; Wenzel et al., 2009). Weiterhin führt eine
Leptinrezeptoraktivierung und insbesondere die Phosphorylierung an der Position Tyr-985
zu einer SHP-2-vermittelten Aktivierung von ERK 1/2 über MEK1 (Banks et al., 2000;
Bjorbaek et al., 2001; Li und Friedman, 1999; Morton und Schwartz, 2011). Zhang et al.
konnten 2004 zeigen, dass eine leptininduzierte Phosphorylierung von ERK 1/2 im
Nucleus arcuatus nach neuronenspezifischem Knockout von SHP-2 signifikant gegenüber
Wildtyp-Mäusen reduziert war (Zhang et al., 2004). Zudem wurde die Bedeutung der
hypothalamischen ERK-Phosphorylierung durch Leptin in vivo-Versuchen deutlich, in
denen eine Blockade von ERK 1/2 die appetithemmenden und gewichtsreduzierenden
Effekte des Leptins aufhob (Rahmouni et al., 2009). Generell ist die SHP-2-induzierte
Aktivierung des Ras/MAPK-Signalweges gut belegt (Dance et al., 2008; Noguchi et al.,
1994; Tang et al., 1995).
Die neuronalen mHypoA-2/23-Zellen zeigten nach Stimulation mit 1 µM Orexin A, 1 µM
Orexin B oder 100 nM Leptin für 15 Minuten keine signifikante Phosphorylierung der
p44/42-MAPK (ERK 1/2). Auch die Hemmung der MAPK-Kinase mit dem MEK-Inhibitor
PD 98059 beeinflusste die NPY-Genexpression nicht (Daten in dieser Arbeit nicht
gezeigt). Dass eine Inhibierung des MAP-Kinase-Signalweges die Hemmung der NPYGenexpression durch Insulin und Östrogen aufzuheben vermag, wurde bereits in
verwandten hypothalamischen Neuronen gezeigt (Mayer und Belsham, 2009; Titolo et al.,
2008). Es konnte in diesen Arbeiten ebenfalls gezeigt werden, dass eine Stimulation der
NPY-Genexpression von der MAPK-Signalkaskade in diesen Neuronen abhängt (Kim et
al., 2010; Titolo et al., 2008).
Die hier vorliegenden Daten weisen erstmals direkte orexinabhängige Leptineffekte auf
die Genexpression des NPY nach. Dass Leptin die Genexpression beeinflusst, ist bereits
belegt. Es liegen sowohl Daten über eine Erhöhung der Genexpression (Jequier, 2002)
als auch über eine Reduktion derer vor (Arora und Anubhuti, 2006; Jequier, 2002;
Stephens et al., 1995). Bei ähnlichen Untersuchungen in anderen in vitro-Modellen wurde
54
Diskussion
ebenfalls sowohl eine Reduktion der NPY-Sekretion bei gleichzeitig unveränderter NPYGenexpression über 24 Stunden beobachtet, als auch eine Erhöhung der NPY-Sekretion
durch Leptin in hypothalamischen mHypoA 38-Zellen. (Dhillon und Belsham, 2011; Magni
et al., 2001). Eine Erklärung für die fehlende leptininduzierte Suppression der NPYmRNA-Konzentration in mHypoA-2/23-Zellen könnte auch die fehlende Möglichkeit der
Interaktion mit verschiedenen anderen Neuronen und Interneuronen sein, die im intakten
Hypothalamus für den erwarteten Effekt erforderlich wären.
Die Protein-Tyrosinphosphatase SHP-2 hat sowohl bedeutenden Einfluss auf den
Energiehaushalt
und
stellt
gleichzeitig
ein
molekulares
Bindeglied
zwischen
Leptin-/Orexinrezeptoren und dem MAP-Kinase-Signalweg dar. Eine gezielte Deletion der
SHP-2 in Neuronen begünstigt die Entwicklung eines metabolischen Syndroms (Banno et
al., 2010; Krajewska et al., 2008; Zhang et al., 2004). Daher wurden die mHypoA-2/23Neurone dahingehend untersucht, ob eine Einzel- bzw. Costimulation mit Leptin und
Orexinen zu signifikanter Phosphorylierung der SHP-2 führt.
Zwei Phosphorylierungsstellen kamen hierfür in Betracht, Tyr-542 und Tyr-580. Die
Einzelstimulation mit Leptin führt zu keiner Änderung der SHP-2-Phosphorylierung am
Tyrosinrest 542 und 580. Unter dem Einfluss von Orexin A oder Orexin B kam es zu einer
Reduktion der Phosphorylierung an der Stelle Tyr-542 um ca. 35 - 40 %. Dass die
alleinige Phosphorylierung an dieser Position ausreicht, um den nachfolgenden MAPKinase-Signalweg zu aktivieren, ist belegt (Lu et al., 2001). Die Phosphorylierungsstelle
Tyr-580 zeigte keine derartige Regulation. Die Wirkung der Costimulation mit Leptin zeigt
Ergebnisse ähnlich den Versuchsgruppen, die mit Orexin A oder Orexin B behandelt
wurden.
Diese
Aussage
gilt
für
beide
SHP-2-Phosphorylierungsstellen.
Dieser
Versuchsaufbau lässt eine Reduktion der SHP-2-Phosphorylierung an der Position Tyr542 durch Orexine vermuten. Diese Aussage muss durch weitere Versuche belegt
werden.
In den aktuellen Untersuchungen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass in
den verwendeten mHypoA 2/23-Neuronen die ERK-1/2-Phosphorylierung von vorheriger
Hemmung der SHP-2 durch den SHP-Inhibitor NSC 87877 unbeeinflusst bleibt. In
HEK293-Zellen hebt diese SHP-2-Inhibierung die Phosphorylierung von ERK 1/2 dagegen
auf (Chen et al., 2006).
Die potentielle Rolle der Orexinrezeptoren in SHP-2-vermittelter Signaltransduktion ist
noch nicht eindeutig geklärt. Kürzlich veröffentlichte Studien von Laburthe et al. wiesen
jedoch eine OX1-vermittelte SHP-2-Aktivierung nach (Laburthe und Voisin, 2012). Über
eine Rezeptoraktivierung phosphorylieren und aktivieren zwei Bestandteile des OX1-
55
Diskussion
Rezeptors namens „immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif“ (ITIM) (Voisin et al.,
2008) und das „immunoreceptor tyrosine-based switch motif“ (ITSM) (El Firar et al., 2009)
die
Tyrosinphosphatase
SHP-2.
Diese
„motifs“
werden
typischerweise
in
Immunrezeptoren wie Fc-γ-Rezeptoren gefunden, aber sind auch in manchen G-Proteingekoppelten Rezeptoren wie den OX1- und OX2-Rezeptoren nachgewiesen worden
(Laburthe et al., 2010). Die Hypothese, die orexinvermittelten aktivierten intrazellulären
Botenstoffe würden mit der leptinabhängig aktivierten SHP-2 über den MAP-KinaseSignalweg die NPY-Genexpression beeinflussen, bestätigte sich in bei den untersuchten
hypothalamischen mHypoA-2/23-Neuronen nicht. Dass diese Signaltransduktion ohne die
bekannten Orexinrezeptor-vermittelten Signalkaskaden über PLC und anschließend PKC
oder IP3 auskommen kann, konnte durch Guo et al. 2012 aufgezeigt werden. Sie
entdeckten, dass eine PKC-unabhängige ERK-Phosphorylierung durch Orexin B in
neuronalen Zellen möglich ist (Guo und Feng, 2012). Eine direkte Interaktion zwischen
Orexinen, Leptin und Neuropeptid Y innerhalb des Hypothalamus und deren Beitrag zur
Regulation der Energiehomöostase wurde bereits nachgewiesen (Horvath et al., 1999).
Weitere Studien sind nötig, um die Orexin/Leptin-Interaktionen genauer zu untersuchen.
In dieser Arbeit erhobene Daten weisen auf derartige Interaktionen hin; Leptin führte unter
zusätzlicher Stimulation mit Orexinen zu einer veränderten Regulation der NPYGenexpression in mHypoA-2/23-Neuronen. Die Ergebnisse von Funato et. al, dass nur in
Anwesenheit
von
Leptin
eine
durch
Orexinüberstimulation
bedingte
negative
Energiebilanz zu erreichen ist (Funato et al., 2009), konnten in diesem In-vitro-Modell auf
molekularer Ebene nicht geklärt werden.
AgRP
Das Agouti-related protein (AgRP) hat sich seit seiner Entdeckung 1997 (Ollmann et al.,
1997; Shutter et al., 1997) als wichtiger Regulator der Energiehomöostase erwiesen
(Stutz et al., 2005). Die Überexpression von AgRP in transgenen Mäusen sowie die
chronische intracerebroventrikuläre Injektion führen zu Polyphagie und begünstigen die
Entwicklung von Übergewicht (Graham et al., 1997; Tang-Christensen et al., 2004),
während eine postembryonale Ablation von AgRP-Neuronen bei Mäusen zu einer
signifikanten Reduktion der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichtes führt (Bewick et
al., 2005). Die Wirkung des Peptids wird über den C-terminalen Anteil vermittelt, der über
einen Antagonismus an Melanocortin 3-, 4-, 5-Rezeptoren (MC3R, MC4R, MC5R) den
anorektischen Effekt des α-MSH hemmt (Fong et al., 1997; Yang et al., 1999). Ferner wird
dem AgRP eine hypothalamisch-hypophysäre Regulation des adrenocorticotropin
56
Diskussion
hormone (ACTH), des prolactin (PRL) und des TSH-releasing hormone (TRH)
zugeschrieben (Fekete et al., 2002; Xiao et al., 2003). Leptin und Insulin hemmen die
Genexpression des AgRP (Ilnytska und Argyropoulos, 2008), während eine Deletion von
Insulin-
oder
Leptinrezeptoren
zu
einer
Erhöhung
intrazellulärer
AgRP-mRNA-
Konzentrationen führt (Korner et al., 2000). Leptin vermag die Aktivität von AgRPNeuronen
im
hypothalamischen
Membranpotentials
rasch
zu
Nucleus
inhibieren
(van
arcuatus
den
Top
durch
et
Änderung
al.,
2004).
des
Nach
Leptinrezeptoraktivierung sind PI3K-(Morrison et al., 2005), AMPK-(Claret et al., 2007)
und JAK-STAT-(Gong et al., 2008) abhängige Signalwege zur Regulation der AgRPGenexpression beschrieben. Der Einfluss der Orexine auf die Genexpression von AgRP
ist kaum untersucht. Lediglich Lopez et al. konnten 2002 zeigen, dass eine
intracerebroventrikuläre Injektion von Orexin A in einer Konzentration von 3 nmol zu
keiner Änderung der AgRP-Genexpression in Zellen des Nucleus arcuatus führt (Lopez et
al., 2002).
In den durchgeführten Experimenten war eine signifikante Reduktion der AgRP-mRNAMenge um 30 % nach 30-minütiger Stimulation mit 1 µM Orexin A, 1 µM Orexin B als
auch mit 100 nM Leptin zu beobachten. Die kombinierte Gabe von 100 nM Leptin und
Orexin B führte zu einem additiven Effekt und senkte die Genexpression gegenüber dem
Effekt der Einzelstimulation um weitere 15 %. Dieser Effekt kann für Orexin A
angenommen werden, lässt sich bei gewählten Signifikanzgrenzen hingegen nicht als
signifikant deklarieren. Der Effekt von Orexin A und Orexin A + Leptin auf die abhängige
Variable unterscheidet sich nicht signifikant. Eine Untersuchung auf potentielle
posttranskriptionelle Modifikation, die den schnellen Effekt erklären könnte, war durch
eine Actinomycin D-induzierte Transkriptionshemmung möglich. Unter Hemmung der
DNA-abhängigen RNA-Synthese zeigte sich keine signifikante Veränderung der
intrazellulären AgRP-mRNA-Konzentration unter dem Einfluss von Leptin und Orexin A
bzw. Orexin B. Dieser Effekt konnte ebenso weder für die Regulation des NPY noch für
das AROM nachgewiesen werden. Die Regulation der AgRP-mRNA lässt sich auf
Transkriptionsebene vermuten, auch wenn der beobachtete Effekt nach 30 Minuten in
einem hierfür doch sehr kurzen Zeitraum erfolgte. Der Unterschied in den Ergebnissen für
NPY und AgRP stellt keine neue Erkenntnis dar. Dass NPY und AgRP im Nucleus
arcuatus atypisch und unterschiedlich reguliert werden können, konnte bereits durch Ross
et al. 2009 an F344 Ratten nachgewiesen werden (Ross et al., 2009). Auch in WistarRatten zeigte sich eine divergente Regulation von AgRP und NPY im Nucleus arcuatus
(Kas et al., 2005). Es ist ebenso belegt, dass spezifische NPY-Neurone im Nucleus
57
Diskussion
arcuatus AgRP-mRNA coexprimieren und beide Peptide parallel reguliert werden (Hahn et
al., 1998). Gleichzeitig wurde durch in-situ-Hybridisierung verifiziert, dass keine AgRPExpression in NPY-Neuronen anderer Hirnregionen wie Hippocampus, Nucleus reticularis
und cerebralem Cortex erfolgt (Hahn et al., 1998). In der hier verwendeten mHypoA-2/23Zellen zeigte sich keine gemeinsame Regulation von NPY und AgRP. Es ergaben sich
ebenso gegenwärtig keine Hinweise darauf, dass der orexin- und leptinbedingte
kurzfristige
Effekt
auf
die
intrazelluläre
AgRP-mRNA-Konzentration
durch
posttranskriptionelle Modifikation der mRNA erklärt werden kann. Eine derartige
Regulation ist für das AgRP bislang auch nicht beschrieben. Lerchen et al. konnten
bereits 1995 zeigen, dass 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) und Forskolin
gemeinsam die Regulation der NPY-Genexpression sowohl über die Transkription als
auch über posttranskriptionelle Mechanismen in Neuroblastom-Zellen (LA-N-5) und
Phäochromozytom-Zellen (PC12) regulieren (Lerchen et al., 1995). In PC12-Neuronen
wird auch die mRNA des Melanin-concentrating hormone (MCH) durch einen
synergistischen Effekt von Lithium und nerve growth factor (NGF) stabilisiert. Bereits nach
30 Minuten war ein signifikanter Anstieg der MCH-mRNA-Konzentration messbar, bedingt
durch eine Erhöhung der mRNA-Stabilität (Presse et al., 1997). Eine posttranskriptionelle
Regulation der Genexpression zusätzlich zur Steuerung der Transkription erlaubt es
Neuronen, sehr schnell und flexibel auf Änderungen der Umwelteinflüsse energieeffizient
zu reagieren (Hargrove und Schmidt, 1989). Besonders der adenin- und uracilreiche
Abschnitt (ARE) im 3‘-UTR Bereich der mRNA ist der am häufigsten mit RNA-bindenden
Proteinen (ARE binding proteins) interagierende Bereich zur Steuerung der mRNAStabilität. Er erlaubt sowohl eine Erhöhung als auch Reduktion der mRNAAbbaugeschwindigkeit. Während beispielweise Hu-Proteine die Stabilität erhöhen
(Bolognani und Perrone-Bizzozero, 2008), führen microRNA (miRNA) typischerweise zu
einem beschleunigten Abbau der mRNA (Kosik, 2006). Kürzlich konnte gezeigt werden,
dass eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration an der Regulation der mRNAStabilität beteiligt ist (Im et al., 2008; Jakoi et al., 1995). Die Ergebnisse der an der
mHypoA-2/23-Zelllinie durchgeführten Experimente lassen darauf schließen, dass sowohl
Orexin A, als auch Orexin B und Leptin die intrazelluläre Ca2+-Konzentration in den
Neuronen erhöhen. Während diese Effekte durch frühere Studien bereits belegt sind
(Muroya et al., 2004; Wang et al., 2008), wurde der Einfluss einer Orexin/LeptinDoppelstimulation auf die intrazellulären Ca2+-Spiegel untersucht. Dosis-Wirkungs-Kurven
legen am ehesten nahe, dass sich die Einflüsse von Orexin A / Orexin B und Leptin auf
die Ca2+-Konzentration addieren. Bei ähnlichen EC50-Werten ist nicht von einer Erhöhung
58
Diskussion
der Orexin- oder Leptinsensitivität auszugehen. Diese Resultate sind kongruent mit den
Ergebnissen der AgRP-Genexpressionsversuche. Ob die Regulation von AgRP in den
mHypoA-2/23-Neuronen über Ca2+-abhängige Signalwege vermittelt wird, ist zurzeit nicht
bekannt. Eine PI3K-vermittelte Beeinflussung ist denkbar (Morrison et al., 2005).
POMC
Proopiomelanocortin (POMC) ist ein Vorläuferprotein, das gewebeabhängig durch
posttranslationale RNA-Prozessierung in die biologisch aktiven Peptide Melanocytestimulating hormones (MSHs), Adrenocorticotropic hormone (ACTH) and β-endorphin
gespalten wird (Millington, 2006). POMC-Neurone finden sich hauptsächlich im
hypothalamischen Nucleus arcuatus und im Nucleus tractus solitarii des Hirnstamms.
Beide Hirnareale haben bedeutenden Einfluss auf die Regulation der Nahrungsaufnahme
und der Energiehomöostase (Cone, 2005). MSHs und ACTH üben ihre anorexigene
Funktion über G-protein-gekoppelte Melanocortinrezeptoren aus, von denen fünf
Subtypen kloniert werden konnten. Besonders der MC3- und der MC4-Rezeptor werden
im zentralen Nervensystem exprimiert (Getting, 2006). Dem Melanocortinsystem wird eine
bedeutende Rolle an der Regulation der Nahrungsaufnahme beigemessen. Eine
genetische Deletion von POMC oder den MC3- bzw. MC4-Rezeptoren fördern die
Entwicklung von Übergewicht (Coll et al., 2004). Während Fasten die POMCGenexpression reduziert, wird sie bei erhöhter Nahrungszufuhr gesteigert (Hagan et al.,
1999; Mizuno et al., 1998). POMC-Neurone im Nucleus arcuatus des mediobasalen
Hypothalamus werden durch Leptin über den Leptinrezeptor (LepRb) reguliert. Sie
beeinflussen
die
Energiehomöostase
über
Projektionen
in
den
dorsomedialen
Hypothalamus, den Nucleus paraventricularis und den lateralen Hypothalamus (Cone,
2005). Auch Orexine beeinflussen POMC-Neurone im Nucleus arcuatus. Es wurde
einerseits gezeigt, dass Orexine die elektrische Aktivität von POMC-Neuronen im
Hypothalamus vermindern können (Ma et al., 2007), andererseits konnten kürzlich
publizierte Daten verifizieren, dass Orexinstimuli bis zu einem dreifachen Anstieg der
Aktionspotentialfrequenz von POMC-Neuronen führen. Der primäre Mechanismus für die
Zellanregung ist die Aktivierung des Na+/Ca2+-Austauschers. Orexine verstärkten
zusätzlich die indirekte Freisetzung der γ-aminobutyric acid (GABA), die die Hemmung
der POMC-Neurone verstärkt. (Acuna-Goycolea und van den Pol, 2009). In den mHypoA2/23-Neuronen wurde der Einfluss des Leptins und der Orexine sowie deren kombinierte
Gabe auf die Genexpression des POMC untersucht. Während eine Veränderung der
POMC -Genexpression durch Orexine in Zellkulturen bislang nicht nachweisbar
59
Diskussion
war (Al-Barazanji et al., 2001), ist eine leptininduzierte Erhöhung der zytosolischen
POMC-mRNA-Konzentration beschrieben (Schwartz et al., 1997). Erwartet wurde eine
durch Leptinstimulation bedingte Steigerung der POMC-Genexpression, wohingegen von
keiner Änderung bzw. einer Hemmung der Genexpression durch Orexinstimulation
ausgegangen wurde. Nach 30 Minuten, einer Stunde und drei Stunden Behandlungszeit
war die POMC-mRNA-Konzentration nach Stimulation mit Leptin und Orexin B signifikant
niedriger als in der Behandlungsgruppe, die nur mit Leptin behandelt wurde. Es lässt sich
aufgrund der erhobenen Daten nicht eruieren, ob dieser auf die mRNA-Konzentration
regrediente Effekt durch Leptin oder Orexin B selbst bedingt ist oder eine signifikante
Reduktion der POMC-mRNA-Konzentration um ca. 30 % durch eine notwendige
Interaktion beider Hormone verursacht ist. Orexin A als Einzelsubstanz hingegen führt zu
einer Reduktion der Genexpression um 25 % nach 30 Minuten Stimulationszeit (vs.
Kontrolle). Die Interaktion verschiedener neuronaler Zellen im intakten Hypothalamus ist
in der mHypoA-2/23-Zelllinie nicht gegeben. Dies könnte erklären, warum die erwartete
Regulation der POMC-Genexpression durch Leptin in den mHypoA 2/23-Neuronen nicht
erfolgte. Weiterhin gilt zu bedenken, dass ein Effekt außerhalb des untersuchten
Messzeitraumes vorliegen könnte. Es sind weitere Untersuchungen nötig, insbesondere
zu dem coexprimierten Cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) (Dhillo et
al., 2002), dessen Produktion in den mHypoA-2/23-Neuronen bereits nachgewiesen
werden konnte.
CRH
Das Corticotropin-releasing hormone (CRH) wurde erstmals 1981 aus dem Hypothalamus
des Schafes isoliert (Vale et al., 1981). CRH-produzierende Neurone befinden sich im
parvozellulären Bereich des hypothalamischen Nucleus paraventricularis (PVN) (Itoi et al.,
2004) und stimulieren die ACTH-Ausschüttung im Hypophysenvorderlappen und somit
indirekt die Cortisolausschüttung der Nebenniere. Beide Peptide schließen über eine
negative Rückkopplung den Regelkreis (Swartz, 1990). Es ist bekannt, dass
Glukokortikoide Einfluss auf das Ernährungsverhalten ausüben (Castonguay, 1991). Eine
bilaterale Adrenalektomie führt zu signifikanter Abnahme der Nahrungsaufnahme,
während sie sich durch Cortisolgabe steigern lässt (Germano et al., 2007; Jacobson,
1999). Durch Steuerung der HPA-Achsen-Empfindlichkeit und Reaktion auf zirkulierende
Glukokortikoide, Insulin und Leptin partizipieren diese CRH-produzierenden Neurone an
der Regulation der Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase (Dallman et al., 1995;
Heiman et al., 1997). CRH vermittelt seine Effekte über zwei G-Protein-gekoppelte CRH-
60
Diskussion
Rezeptor-Subtypen: der CRH-1-Rezeptoraktivierung induziert Angstzustände und erhöht
die HPA-Achsenempfindlichkeit, während der CRH-2 Rezeptor die Suppression der
Nahrungsaufnahme vermittelt (Chotiwat et al., 2010; Koob und Heinrichs, 1999). Für
Leptin wird eine Senkung der CRH-mRNA-Expression im Nucleus paraventricularis und
eine Erhöhung im Nucleus interstitialis striae terminalis (BNST) beschrieben (Arvaniti et
al., 2001; Makino et al., 1994). Auch den Orexinen wird eine regulierende Funktion der
HPA-Achse durch Beeinflussung der CRH-Freisetzung zugeschrieben. Die Orexine A und
B erhöhen die c-fos-mRNA-Expression, deren Bedeutung als Bindeglied zwischen Stress
und Erhöhung der Nahrungsaufnahme 2011 beschrieben wurde (Chagra et al., 2011). Für
Orexin A ist gezeigt, dass es die CRH-Expression in Neuronen des PVN steigert sowie
deren Freisetzung (Al-Barazanji et al., 2001; Russell et al., 2001). Menschen, die unter
Narkolepsie leiden, zeigen auch eine geringere ACTH- und Cortisolausschüttung (Kok et
al., 2002). Die mHypoA-2/23-Neurone wurden daraufhin untersucht, ob deren CRHGenexpression durch Einzel- oder kombinierte Stimulation von Orexinen oder Leptin
reguliert wird. Nach 12 Stunden ließ sich eine signifikante Reduktion der intrazellulären
CRH-mRNA nach Stimulation mit Orexin A um 35 – 40 % messen. Eine zusätzliche Gabe
von Leptin verstärkte diesen Effekt nicht, sondern hatte eher einen gegensätzlichen
Effekt. Die Behandlung mit Orexin B führt zu einem ähnlichen Ergebnis: das
Signifikanzniveau wurde allerdings nicht erreicht. Nach 1,3 und 6 Stunden ist ein Trend
zur Erhöhung der mRNA-Expression durch Orexine und Leptin erkennbar. Dieser
verfehlte jedoch das Signifikanzniveau. Mit diesen Ergebnissen vereinbar wäre eine
kürzlich an ähnlichen mHypoE-N44-Neuronen gezeigte ultradiane Rhythmik der CRHExpression, deren Oszillation etwa 18 Stunden beträgt (Fick et al., 2010). Neue in vivoUntersuchungen konnten zeigen, dass eine Inhibition beider Orexinrezeptoren zu keiner
Veränderung der endokrinen HPA-Achsen-Funktion bei Ratten führt (Steiner et al., 2012).
AROM / PARP1-bindendes Protein
Bei
der
Untersuchung
der
amplifizierten
cDNA-Fragmente
durch
Agarosegelelektrophorese fehlte die erwartete Bande für das Melanin-concentrating
hormone (MCH) bei 149 Basenpaaren. Stattdessen waren etwa 400 Basenpaare große
Fragmente erzeugt worden. Detaillierte Untersuchungen des MCH-Gens ließen erkennen,
dass ein 253 Basenpaare großes Intron im vom Primerpaar flankierten Genabschnitt liegt.
Bei der amplifizierten cDNA handelt es sich um das 402 Basenpaare große antisenseRNA-overlapping-MCH-gene (AROM) oder PARP1-bindendes Protein. Die Bezeichnung
61
Diskussion
PARP bezeichnet die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1). Sie ist ein DNAbindendes Enzym, das unter Verwendung von nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)
Poly-ADP-Ribose an Nukleinsäuren anfügt. Es ist an der DNA-Reparatur bei homologer
Rekombination, an der Genstabilität über RNA-Prozessierung und der Apoptose beteiligt
(Abd Elmageed et al., 2012; Cohausz und Althaus, 2009; Leung et al., 2011). Die
mHypoA-2/23-Neurone exprimieren keine MCH-mRNA. Die hier detektierte Splicevariante
ist komplementär zum 3‘-flankierenden Bereich des MCH-Gens und kodiert für DNA/RNAbindende Domänen (Borsu et al., 2000).
Hinsichtlich
der
AROM-Genexpression
konnte
in
den
mHypoA-2/23-Zellen
ein
signifikanter Unterschied zwischen der mit Leptin und jener mit Leptin und Orexin B
behandelten Neuronenpopulation nach einer Stunde nachgewiesen werden. Ebenso
ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der mit Orexin B und der Gruppe, die
mit
Orexin
B
und
Leptin
gleichzeitig
behandelt
wurde
(nach
drei
Stunden
Behandlungsdauer). Die kombinierten Stimulationen führten zu einer Reduktion der
mRNA um 20 - 30 % (Abb. 16). Es lässt sich aufgrund der erhobenen Daten nicht
erschließen, ob dieser auf die mRNA-Konzentration hemmende Effekt durch Leptin oder
Orexin B selbst bedingt ist oder eine signifikante Reduktion der AROM-mRNAKonzentration durch eine Interaktion beider Hormone ausgelöst wird. Zudem deuten die
erfolgten Untersuchungen unter Transkriptionshemmung an, dass durch Orexine oder
Leptin keine signifikante Beeinflussung der posttranskriptionellen Modulation der mRNA
erfolgt.
Die
beobachteten
Unterschiede
lassen
daher
Modifikationen
auf
Transkriptionsebene vermuten. Antisense-Transkription des MCH-Gens wurde erstmals
1995 bei Ratten nachgewiesen (Hervieu und Nahon, 1995) und 1998 im menschlichen
Hypothalamus (Miller et al., 1998). Der Nachweis der Gensequenz in murinen Embryonen
gelang im Jahre 2002 (Okazaki et al., 2002). Nähere Untersuchungen des Transkriptes
könnten die Expression dieser Spleißvariante in mHypoA-2/23-Neuronen sichern. In
PC12-Zellen ist beschrieben, dass eine Hemmung der Transkription der antisense MCHExpression zu einer Erhöhung der MCH-mRNA führen könnte (Borsu et al., 2000).
Während diese Zellen das MCH und das antisense MCH simultan exprimieren und so die
RNA-Produktion als auch die Stabilität der MCH-mRNA regulieren, stellt die mHypoA2/23-Zelllinie ausschließlich das antisense-Transkript her. Daher eignen sich diese
Neurone als Modell für weitere Untersuchungen des antisense-RNA-overlapping-MCHgene (AROM).
62
Diskussion
Orexinrezeptoren
Die Orexinrezeptoren (OX1R, OX2R) sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, deren
Aminosäuresequenz eine 64-prozentige Übereinstimmung aufweist. Orexin A und Orexin
B binden mit annähernd gleicher Affinität an den OX2R, während Orexin A gegenüber
Orexin B mit 10-fach höherer Affinität an den OX1R bindet (Sakurai et al., 1998). Durch
geringe
Sequenzhomologie
(30
%)
gegenüber
anderen
G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren, bindet der OX1R und OX2R außer den Orexinen keine anderen
Neurotransmitter (Holmqvist et al., 2001; Kukkonen et al., 2002). Im zentralen
Nervensystem werden die Orexinrezeptoren überwiegend in Neuronen des Hypothalamus
exprimiert, dem Zentrum der Steuerung von Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase.
Dabei ist ein unterschiedliches Expressionsverhältnis von OX1R zu OX2R in den einzelnen
Kerngebieten beschrieben (siehe Abb. 27). Jöhren et al. konnten erstmals die Expression
von OX1- und OX2-Rezeptoren in peripheren Geweben nachweisen sowie einen
Geschlechtsdimorphismus aufzeigen (Jöhren et al., 2004; Jöhren et al., 2001; Jöhren et
al., 2002). Je nach Orexinrezeptor-tragender Zelle und deren Lokalisation sind folgende
intrazellulären Signalkaskaden nach Rezeptorstimulation beschrieben: Gq-gekoppelte
Aktivierung der Phospholipase C führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+Konzentration (Smart et al., 1999). Neben Gs-Proteinen können auch inhibitorische Giund Go-Proteine aktiviert werden (Beuckmann und Yanagisawa, 2002; Karteris et al.,
2005).
Abbildung 27: Expressionsverhältnis von OX1R zu OX2R in hypothalamischen Kerngebieten.
ARC-Nucleus arcuatus, DMH-dorsomedialer Hypothalamus, DR-Nucleus raphe dorsalis, GABA-γAminobuttersäure, LC-Locus coeruleus, LHA-lateraler Hypothalamus, PFA-Nucleus perifornicalis,
POA-Nucleus praeopticus, PVN-Nucleus periventricularis, SCN-Nucleus suprachiasmaticus, SONNucleus supraopticus, TMN-Nucleus tuberomamillaris, VLPO-Area preoptica ventrolateralis, VMNNucleus ventromedialis, VTA-Area tegmentalis ventralis; Abbildung aus Machaalani et al., 2013,
Seite 3.
63
Diskussion
Wie
bereits
zuvor
beschrieben
ist
auch
eine
direkte
Beeinflussung
der
Tyrosinphosphatase SHP-2 sowie eine G-Protein-gekoppelte Aktivierung des MAPKinase-Signalweges möglich (El Firar et al., 2009; Tang et al., 2008; Voisin et al., 2008).
Dass die Genexpression dieser Rezeptoren auf Veränderungen der Stoffwechsellage
reagiert, ist bereits vorbeschrieben. Fasten führt in den ersten 12 Stunden zu geringer
oder ausbleibender Reduktion der Genexpression von OX1R und OX2R. Nach 12 bis 24
Stunden ist eine Erhöhung der Genexpression von PPO, Orexin A, Orexin B und deren
Rezeptoren nachgewiesen, die bereits nach 48 Stunden vollständig reversibel ist
(Machaalani et al., 2013). Da bereits gezeigt werden konnte, dass die Genexpression der
Rezeptoren durch Orexine selbst beeinflusst (Wenzel et al., 2009) sowie gewebeabhängig
bei Nahrungskarenz reguliert werden (Karteris et al., 2005), wurden auch die mHypoA2/23-Neurone
auf
eine
potentielle
Modulation
der
Rezeptoren
untersucht.
Im
Beobachtungszeitraum von 12 Stunden zeigte sich keine signifikante Veränderung der
Genexpression nach Einzel- oder Doppelstimulation mit Orexinen und Leptin.
64
Diskussion
4.3
Diskussion der Limitationen dieser Studie und Ausblick
Zellkultur
Die gewählte Zelllinie mHypoA-2/23 wurde aufgrund eines für diese Studie geeigneten
Expressionsprofils ausgewählt. Gewonnen wurde sie durch Immortalisation von Neuronen
aus
murinen,
hypothalamischen
Primärkulturen.
Der
genaue
hypothalamische
Ursprungsort lässt sich nicht bestimmen, war jedoch für die Fragestellung (potentielle
Interaktionen zwischen Orexinen und Leptin in hypothalamischen Neuronen) auch nicht
erforderlich. Interaktionen zu anderen Neuronen im Hypothalamus und dem gesamten
Nervensystem sind im Vergleich zu in vivo-Untersuchungen bei dieser Zellkultur nicht
möglich und daher zu berücksichtigen, wenn Ergebnisse nicht die erwartete Aussage
liefern.
Aussagen
zur
Signalinteraktion
erscheinen
bei
diesem
Modellsystem
repräsentativer als grundsätzliche Aussagen zum Energiestoffwechsel. Die Tatsache,
dass orexigene und anorexigene Peptide gleichzeitig exprimiert werden, legt den Schluss
nahe, dass diese Zelllinie mehr als einen Zellklon enthält und weiter subkloniert werden
könnte. Bei mHypoE N29-Neuronen ist dies bereits geschehen und vier Subklone konnten
isoliert werden (Belsham et al., 2004). Da keine Voruntersuchungen an dieser
Zellpopulation in der Literatur beschrieben sind, lassen sich hier dargelegte Ergebnisse
bislang nicht mit Vorarbeiten vergleichen. Für genauere Studien an reinen NPY-Neuronen
sei auf kürzlich erhältliche mHypoA NPY/GFP-Neurone verwiesen, um hier dargelegte
Ergebnisse zu verifizieren und ihre biologische Relevanz besser zu beurteilen.
Methodik
Um eine statistische Aussagekraft zu erhalten, ist in den meisten Experimenten eine
Fallzahl von 3 - 4 unabhängigen Versuchen gewählt worden. Für die jeweiligen
Fragestellungen wurde die dafür sinnvollste Methode gewählt und daher unterschiedliche
Techniken verwendet. Weitere Untersuchungen erscheinen daher sinnvoll. Höhere
Fallzahlen würden selbstverständlich statistisch aussagekräftigere Ergebnisse liefern und
die Repräsentativität erhöhen. Die Untersuchung der hier beschriebenen Interaktionen an
mehreren Zelllinien verbessert die Beurteilbarkeit der Ergebnisse.
65
5.
Zusammenfassung
Den hypothalamischen Neuropeptiden Orexin A und Orexin B (Hypocretin A und B) wird
eine Steigerung der Wachsamkeit und des körperlichen Erregungsniveaus zugeschrieben
sowie eine Regulation der Energiehomöostase und des Belohnungssystems. Nach
aktuellem Stand der Forschung führt eine transgene Überexpression von Orexinen zu
einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber der Entwicklung hochkalorischer,
ernährungsbedingter Fettleibigkeit und Insulinunempfindlichkeit, bedingt durch eine
Förderung des Energieverbrauches und einer verringerten Nahrungsaufnahme. Dieser
schützende Effekt erfordert die Funktionalität der durch Leptin aktivierten intrazellulären
Signalwege.
Orexine
verbessern
die
Leptinsensitivität
bei
ernährungsbedingter
Fettleibigkeit über OX2-Rezeptoren (Funato et al., 2009).
Eine Untersuchung der diesen beobachteten Effekten zugrunde liegenden intrazellulären
Mechanismen erfolgte bislang nicht.
In der vorliegenden Arbeit wurde der intrazelluläre Einfluss des Orexinsystems auf die
leptinregulierte Genexpression hypothalamischer appetitregulierender Neuropeptide
untersucht. Das Ziel dieser Untersuchungen war die Identifikation molekularer
Mechanismen der Interaktion von Leptin- und Orexinsystem auf zellulärer Ebene.
Bei der funktionellen Charakterisierung der immortalisierten hypothalamischen Zelllinien
mHypoE-N25, mHypoE-N41 und mHypoA-2/23 erwies sich Letztere als geeignetes
Modellsystem für die geplante Studie.
Die Untersuchungen dieser Arbeit weisen erstmals intrazelluläre Interaktionen zwischen
leptin- und orexinvermittelter Signaltransduktion mit signifikanter Beeinflussung der
Genexpression appetitregulierender hypothalamischer Neuropeptide nach. Orexine
beeinflussten in diesen Zellen signifikant die durch Leptin regulierte NPY-Genexpression.
Der kausale Mechanismus ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Zudem konnte
gezeigt werden, dass NPY und AgRP in diesen Zellen verschiedenartig reguliert werden.
Diese Effekte sind nicht durch eine orexin- oder leptinvermittelte Veränderung der
posttranskriptionellen Genregulation bedingt. Andere untersuchte Neuropeptide, die an
der Regulation der Energiehomöostase beteiligt sind, ließen ebenfalls eine Beeinflussung
der leptinabhängigen Genexpression durch das Orexinsystem erkennen. Die in dieser
Arbeit
zudem
erstmals
durchgeführte
funktionelle
Charakterisierung
dieser
Neuronenpopulation führte zu dem Expressionsnachweis des AROM (antisense-RNAoverlapping-MCH gene) anstelle der erwarteten Synthese des MCH (Melaninconcentrating hormone).
66
Zusammenfassung
Im Folgenden wurden synergistische Effekte von Orexinen und Leptin auf intrazelluläre
Signalwege untersucht. Es zeigte sich eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+Konzentration nach Stimulation mit Leptin und Orexinen sowie ein additiver Effekt von
Leptin und Orexin A bzw. Orexin B. Von einer Veränderung der Orexin- oder
Leptinsensitivität ist aufgrund der erhobenen Daten nicht auszugehen. Eine Stimulation
mit Leptin führte zu einer Phosphorylierung von STAT3. Orexin A und Orexin B
phosphorylierten das STAT3 nicht. Western Blot-Analysen ermöglichten die Untersuchung
der Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase (SHP-2) sowie des
MAP-Kinase-Signalweges. Es zeigten sich Hinweise für eine Reduktion der SHP-2Phosphorylierung durch Orexine an der Position Tyr-542. Anhaltspunkte für eine
synergistische Regulation durch Orexine und Leptin fanden sich nicht. Die Hemmung der
SHP-2 durch den SHP-Inhibitor NSC-87877 führte zu keiner signifikanten Beeinflussung
des Phosphorylierungsstatus von ERK1/2.
Weitere
Untersuchungen
erscheinen
notwendig,
um
die
molekulargenetischen
Interaktionen zwischen den an der Steuerung von Appetit und Energiehomöostase
beteiligten Hormonen Leptin und Orexin A bzw. Orexin B sowie deren Bedeutung für den
Energiestoffwechsel weiter zu erforschen und zum erweiterten Verständnis der
Regulationsmechanismen von Appetitsteuerung und Energiehaushalt beizutragen, um
therapeutische Optionen zu erweitern.
67
6.
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82
7.
Anhang
verwendete Geräte
Geräte
Hersteller
ABI PRISM 7000
Applied Biosystems (USA)
Absaugvorrichtung SUE 300
Heto (DK)
Autoklav
Dargatz (DE)
Biofuge fresco
Heraeus Instruments (DE)
Brutschrank
Heraeus Instruments (DE)
Eismaschine Scotsman AF 10
Scotsman (DE)
Fastblot B43
Biometra (USA)
Feinwaage BP 210 D
Sartorius (DE)
FLUOstar OPTIMA Basisgerät 2003-8143
BMG LABTECH (USA)
Gefrierschrank (-80 °C)
Colora (DE)
Gefrierschrank (-20 °C)
Bosch (DE)
Heißluftsterilisator SUT 6060
Heraeus Instruments (DE)
HLC Blockthermostat
Hassa Laborbedarf (DE)
Konfokalmikroskop TCS SP5
Leica (DE)
Kühlschrank (2-8 °C)
Bosch (DE)
Mikroskop IM35
Zeiss (DE)
Mikrowelle
Cortina (DE)
Mini PP Typ P21 (Netzteil)
Biometra (USA)
Multigel
Biometra (USA)
Multipette plus
Eppendorf (DE)
Multitemp II Thermostatic Circulator
LKB Bromma (CA)
Nucleic Acid Prep Station 6100
Applied Biosystems (USA)
Pipetus
Hirschmann Laborgeräte (DE)
Plateshake DELFIA 296-003
PerkinElmer (USA)
Power Pac 200, 300, 3000 (Netzteil)
Bio-Rad (DE)
Schüttler: „Silent Rocker“
CTI Science (USA)
serologische Pipette 5, 10, 25 ml
Greiner Bio One (DE)
Sicherheitswerkbank BHA 48
Faster (IT)
83
Anhang
Stoppuhr
Junghans (DE)
Sub-Cell GT Agarose-Gelelektroph.-System
Bio-Rad (USA)
SW1-VL Schüttelwasserbad 20 Liter
Julabo (DE)
Tischzentrifuge MIKRO 200R
Hettich (DE)
Thermal Cycler T1
Biometra (USA)
verschiedene Laborglasgeräte
Vortex REAX 2000
Heidolph (DE)
VF2 Vibrationsmischer
Janke und Kunkel (DE)
Waage MC1 Laboratory LC220S
Sartorius (DE)
Zählkammer
Fuchs-Rosenthal (DE)
Zentrifuge Typ C 412
Jouan (DE)
verwendete Verbrauchsmaterialen
Verbrauchsmaterial
Hersteller
96-Well optical reaction plate
Applied Biosystems (GB)
Cellstar tissue cultures flasks
Greiner Bio One (DE)
Filter tips 10, 100, 200 µl
Greiner Bio One (DE)
Filter tips 100, 1000 µl
Sarstedt (DE)
Filtersysteme für die ABI Prism AM 6100
Applied Biosystems (GB)
Gel-Loadertips 1-200 µl
A. Hartenstein (DE)
Klebefolie, optisch klar
Sarstedt (DE)
Nitrozellulosemembran
Carl Roth (DE)
Multiply PCR Plate 96 Well
Sarstedt (DE)
Parafilm
American National Can (USA)
TransBlot Transfer Medium (0,4 µM)
Bio-Rad (USA)
Vinyl-Einmalhandschuhe
Meditrade (DE)
Wägepapier
Neolab (DE)
Zellkulturplatte (6-Well; 24-Well)
Greiner Bio One (DE)
Zellkulturplatte (96-Well,schwarz)
Greiner Bio One (DE)
84
Anhang
verwendete Chemikalien und Reagenzien
Verbrauchsmaterial
Hersteller
10x TAE Puffer
Invitrogen (CA)
Actinomycin D
Sigma-Aldrich (USA)
Agarose NEEO
Carl Roth (DE)
Albumin Standard
Thermo Scientific (USA)
Aprotinin
Sigma-Aldrich (USA)
BCA Protein Assay Reagent A
Thermo Scientific (USA)
BCA Protein Assay Reagent B
Thermo Scientific (USA)
BSA (Proteasefrei)
PAA Laboratories (AT)
CA-630 Igepal®
Sigma-Aldrich (USA)
Cloned AMV First-strand cDNA
Invitrogen (CA)
DAPI Nucleic Acid Stain
Invitrogen (CA)
DMEM High Glucose (4,5g/l, mit L-Glutamin)
PAA Laboratories (AT)
DMSO
Sigma-Aldrich (USA)
2+
Dulbeccos PBS ohne Ca & Mg
2+
PAA Laboratories (AT)
Elutions-Puffer
Applied Biosystems (GB)
Ethidiumbromid
BioRad Laboratories (CA)
FBS Gold
PAA Laboratories (USA)
Gel-Marker DNA Molecular Weight
Marker 14 0,25 µg/µl (50µg = 1A260 U)
Roche (CH)
Glycerin
Merck (DE)
Laemmli sample Buffer 30 ml
Bio-Rad (USA)
Leptin (mouse) L3772-1 mg
Sigma-Aldrich (USA)
Leupeptin
Sigma-Aldrich (USA)
Marker SMO 671 (10-170 kDa)
Fermentas (DE)
Milchpulver Blotting grade 500g
Roth (DE)
Na-ETDA-Lösung (0,5 M; pH 8,0)
Invitrogen (CA)
Natriumfluorid (NaF)
Sigma-Aldrich (USA)
Natriumorthovanadat (Na3VO4)
Sigma-Aldrich (USA)
Nucleic Acid Purification Lysis solution
Applied Biosystems (GB)
Orexin A H-4172-1mg
Bachem (CH)
Orexin B H-4174-1mg
Bachem (CH)
Penicillin/Streptomycin
BioWhittaker (BE)
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)
Sigma-Aldrich (USA)
85
Anhang
Platinum SYBR Green qPCR SuperMix- UDG Invitrogen (CA)
with ROX
Quant-iT-RiboGreen-RNA-Assay-Kit
Invitrogen (CA)
RNA Purification Wash Solution I
Applied Biosystems (GB)
RNA Purification Wash Solution II
Applied Biosystems (GB)
Roti-Free Stripping Puffer
Roth (DE)
Scybr Green I Reaction System
Eurogentec SA (DE)
TEMED 95 %
Roth (DE)
Tris-HCl-Lösung (1 M; pH 7,4)
Sigma-Aldrich (USA)
Trypsin
Sigma-Aldrich (USA)
verwendete Antikörper
Antikörper
Hersteller
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)
Life Technologies (USA)
Anti-rabbit IgG, HRP-linked #7074
Cell Signaling (USA)
Anti-mouse Peroxidase linked NA931V
GE Healthcare (GB)
β-Tubulin #2146S
Cell Signaling (USA)
β-Actin #4967
Cell Signaling (USA)
p44/42-MAPK (ERK 1/2)
Cell Signaling (USA)
Phospho-p44/42-MAPK (Thr202/Tyr204)
Cell Signaling (USA)
Phospho-SHP-2 (Y542) #3751S
Cell Signaling (USA)
Phospho-SHP-2 (Y580) #3703S
Cell Signaling (USA)
®
Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP Rabbit
Cell Signaling (USA)
SH-PTP2 (B1)
Santa Cruz (USA)
verwendete Zelllinien
Zelllinie
Vertreiber
mHypoA-2/23
CELLutions Biosystems (USA)
mHypoE-N25/2
CELLutions Biosystems (USA)
mHypoE-N41
CELLutions Biosystems (USA)
NCI-H295R
bezogen über TU Dresden
Ländercodes gemäß ISO-3166
86
Anhang
verwendete Zellkulturmedien, Puffer, Lösungen und Gele
Grundmedium
bestehend aus
DMEM mit
Glukose
4,5 g/l
Pyridoxin und Glutamax®
fetales Rinderserum (FBS Gold)
10 %
Penicillin
100 U/ml
Streptomycin
100 µg/ml
Nährmedium für Experimente
bestehend aus
DMEM mit
Glukose
4,5 g/l
Pyridoxin und Glutamax®
fetales Rinderserum (FBS Gold)
0 - 10 %
DEPC-Wasser
bestehend aus
destilliertes Wasser
50 %
DEPC
50 %
Lysispuffer (Vorbereitung für RNA-Extraktion)
bestehend aus
Nucleic Acid Purification Lysis solution
50 %
DEPC-Wasser
50 %
87
Anhang
Lysispuffer (Vorbereitung für Western Blot)
bestehend aus
Tris HCl
50 mM
Natriumchlorid (NaCl)
150 mM
Triton X-100
0,5 %
Glycerin
10 %
CA-630 Igepal®
1%
Natriumorthovanadat (Na3VO4)
2 mM
Natriumfluorid (NaF)
20 mM
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)
1 mM
Leupeptin
5 µg/ml
Aprotinin
5 µg/ml
Transferpuffer
bestehend aus
Tris
3,03 g
Glycin
14,42 g
Methanol
20 %
ergänzt mit Aqua dest. auf 1 l Gesamtlösung
Elektrophoresepuffer
bestehend aus
Tris
30,28 g
Glycin
144,12 g
SDS
10 g
ergänzt mit Aqua dest. auf 1 l Gesamtlösung
88
Anhang
Waschpuffer (TBS/ TBST)
bestehend aus
TBS 10x
(pH 7,6)
24,2 g Tris
80 g Natriumchlorid (NaCl)
Aqua dest.
Ʃ = 1000 ml
TBST
TBS
50 ml
Aqua dest.
450 ml
Tween (für TBST)
0,5 ml
Ʃ ~ 500 ml
Blockpuffer (5 % skin milk)
bestehend aus
TBS 10x
15 ml
Aqua dest.
135 ml
Milchpulver
7,5 g
Tween
0,15 ml
Ʃ ~ 150 ml
Primär-Antikörper-Puffer
bestehend aus
TBS 10x
2 ml
Aqua dest.
18 ml
BSA
1g
Tween
0,02 ml
Ʃ ~ 20 ml
89
Anhang
Laemmli-Puffer
bestehend aus
ß-Mercaptoethanol
0,05 ml
Laemmli sample buffer
0,95 ml
Ʃ = 1ml
Acrylamidgele
bestehend aus
Trenngel (10 %)
Sammelgel
Aqua dest.
5,9 ml
2,1 ml
Acrylamidmix (30 %)
5,0 ml
0,5 ml
1,5 M Tris (pH 8,8)
3,8 ml
0,38 ml (pH 6,8)
SDS (10 %)
0,15 ml
0,03 ml
Ammoniumpersulfat (APS)
0,15 ml
0,03 ml
TEMED
0,006 ml
0,003 ml
Ʃ~15 ml
Ʃ~3 ml
TE-Puffer (pH 7,4)
bestehend aus
1 M HCl-Puffer (pH 7,4)
0,1 ml
0,5 M EDTA-Lösung (pH 8)
0,02 ml
DEPC-Wasser
10 ml
Ʃ ~ 10 ml
Ladepuffer für die Gelelektrophorese
bestehend aus
Glycerol
0,6 ml
2,5 % Xylen-Cyanol-Lösung
0,2 ml
DEPC-Wasser
1,2 ml
Ʃ ~ 2 ml
90
a
8.
Danksagung
Ich möchte mich bei Herrn Prof. Dr. Olaf Jöhren für die Möglichkeit bedanken, mich seiner
Arbeitsgruppe anschließen zu dürfen. In den Jahren, in denen diese Arbeit entstand, habe
ich stets sehr wertvolle Hilfestellungen sowie Unterstützung zum wissenschaftlichen
Arbeiten erhalten. Auch für die wertvollen Ratschläge, die über das Forschungsthema
hinaus gingen, bedanke ich mich bei ihm. Dem früheren Direktor des Institutes für
Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie, Herrn Prof. Dr. med. Peter Dominiak und
dem jetzigen Direktor, Herrn Prof. Dr. med. Markus Schwaninger danke ich dafür, dass
ich im Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie Forschung betreiben
durfte.
Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. Hendrik Lehnert für das Masterclass-Stipendium Innere
Medizin und die Möglichkeit einer Zusammenarbeit mit Dr. Carla Schulz und Dr. Kerstin
Wernecke im Labor für Experimentelle Neuroendokrinologie.
Für die Förderung durch das Promotionsstipendium „Exzellenzmedizin“ möchte ich mich
ebenso bedanken.
Auch gilt mein Dank Marten Obernolte, Dr. Jan Wenzel, Nils Hübel sowie den MTA
Christine Eichholz, Conny Magnussen und Ines Stölting für die praktische Hilfe während
der Laborarbeit und die fortwährende Motivation.
Mein besonderer Dank gilt denjenigen Menschen, die ich während meines Studiums
kennenlernen durfte und die mich persönlich nachhaltig geprägt haben, insbesondere
Catherina Schittko, Marten Obernolte, Florian Buhrke, Alexander Jobs, Niklas Gebauer
und Anne Kautzky.
Der größte Dank gilt meiner gesamten Familie, deren bedingungsloser Unterstützung ich
mir im Leben stets sicher sein durfte.
91
9.
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name:
Geburtsdatum:
Martin Borlich
04.05.1986
Schule
2005
Abitur, Wilhelm Raabe Gymnasium Magdeburg
Beruflicher Werdegang
04/2005 - 12/2005
Zivildienst, Internistische Intensivstation
Otto von Guericke-Universität Magdeburg
01/2006 - 03/2006
Ausbildung zum Rettungssanitäter
DRK Bildungswerk Nord, Berlin
04/2006 - 09/2006
Ausbildung zum Rettungsassistenten
MED-ECOLE, Kiel
10/2006 - 05/2013
Studium der Humanmedizin, Universität zu Lübeck
10/2009 - 12/2012
Experimentelle Arbeiten im Rahmen der Dissertation
seit 10/2013
Assistenzarzt, Kardiologie / Elektrophysiologie
Herzzentrum der Segeberger Kliniken GmbH, Bad Segeberg
Weiterbildung
2006 - 2012
Werkstudent (Notaufnahme und chirurgische Intensivstation),
Universität zu Lübeck
2007 - 2010
Ehrenamtlicher Mitarbeiter beim DRK Lübeck im Bereich
Rettungsdienst, Sanitätsdienst und Katastrophenschutz
Wissenschaftliche Förderungen/Auszeichnungen
2011
Stipendiat der Lübecker „Exzellenzmedizin“
(Promotionsstipendium)
2011 - 2013
Stipendiat der e-fellows.net-Stiftung
2012
Teilnehmer und Stipendiat der Masterclass - Innere Medizin
unter Leitung von Prof. Dr. Dr. h.c. H. Lehnert, FRCP, FACP
Medizinische Klinik I, Universität zu Lübeck
92

Dissertation Borlich - Zentrale Hochschulbibliothek Lübeck