Universitätsfrauenklinik Mainz/Wien
Universitäts-Kinderwunschzentrum
Johannes Gutenberg Universität Mainz
Image der Reproduktionsmedizin ist nach
außen eher schlecht
Ängste - Vorbehalte
Angst vor Missbrauch
„Designerbaby“ zB.
durch PID
unter Kollegen :
ebenfalls schlechtes Image
Reske 2003
Embryonenschutzgesetz
droht mit Gefängnis und
hohen Geldstrafen!
„Patienten
sehen dies
anders“ Seeler, 2003
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A R T – Artificial Reproductive Techniques
Moderne Stimulationstherapien – long, short, ultra-short
(rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/Antagonisten etc.)
AIH (artificial insem. homologous)
IUI - intauterine insemination
AID (artificial insem. donor)
IVF – In vitro Fertilisation
ICSI – Intacytoplasmatic Sperm Transfer
MESA - Mikrochirurgische epidymale Spermatozonaspiration
TESE – Testikuläre Spermien Extraction aus Hoden
IMSI - Intrazytoplasmatische Morphologisch Selektierte Spermien
Injektion
A R T – Artificial Reproductive Techniques
PICSI - Methode zur Selektion reifer Spermien in
Picsi-Schale
TUNEL - Terminale Desoxyribosyl-Transferase
(TdT) mediated dUTP nick end labeling
Assisted Hatching - Schlüpfhilfe
ET „klassischer Embryotransfer“ - Tag 2 - 3
Blastocystentransfer - Tag 4 - 5
Kryoverfahren – „slow cooling“ versus Vitrifikation
Präimplantationsdiagnostik –
Polkörperdiagnostik (PKD)
Präimplantationsdiagnostik (PID)
Stimulationsbehandlung
Kontrollierte ovarielle Stimulation
Zielsetzung:
 Heranreifen eines od. mehrerer Follikel aus Follikelkohorte
 Bei IVF / ICSI:
– Vermeidung der spontanen Ovulation
– Gewinnung mehrerer reifer Eizellen (Metaphase II)
 Bei IUI + VZO*:
– Heranreifen von 1 – max. 3 Eizellen
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* Verkehr
Optimum
* Verkehr zum
ovul.zum
Optimum
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Long-Agonisten Schema mit rFSH
Progesteron Vag.
Transvaginale
Punktion
Nach 2-3 Wochen
Kontrolle der
„down regulation“
GnRH – Agonist
Depot Tag
19-21 des
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Vorzyklus
150 – 300 IE rFSH
ab Tag 3
vag.Sono
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Canaria
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ev.E
2,
Menstruation
10000 IE
HCG
Follikel
Embryotranfer
> 18mm
Zwei – bis 8zeller
E2> 350
6
pro Follikel
Short Antagonistenschema mit Mehrfachgabe
Progesteron Vag.
GnRH-Antagonist
0,25 mg
Tranvaginale
Punktion
5-1000 IE hCG
rFSH
7 8 9
1 2 3 4 5
Stimulationstage
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Vag. Sono
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ev. -E2
Embryotransfer
2-8 Zellstadum
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IMSI
Intrazytoplasmische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion
Spermienfaktoren, die negativen Einfluss auf die embryonale Entwicklung
haben, sind v.a. durch eine verminderte Spermienreife bedingt. Hierzu zählen
u. a. DNA-Fragmentationen. Alle bisher zur Verfügung stehenden Diagnosemittel
waren invasiv, wodurch eine Weiterverwendung der Spermien nicht möglich war.
Die IMSI erlaubt ein Screening der Spermien bei sehr hoher Vergrößerung mit
einem speziellen Invertmikroskop mit Videokamera und Computer
(6000x – 10 000x) ohne Färbung in Echtzeit. Dadurch kann ein Spermium
bezüglich seiner morphologischen Integrität seines Nukleus analysiert werden.
Zahlreiche Publikationen haben gezeigt, dass eine Prä-Selektion des Spermaozoons
für eine erfolgreiche ICSI essentiell ist. ICSI mit Spermien, die mittels hoher
Vergrößerung ausgewählt wurden, ergaben eine höhere Schwangerschaftsrate,
speziell in Fällen wo das Ausmaß an DNA-Fragmentationen im Spermium besonders
hoch war.
400x
ICSI
IMSI
IMSI
Bartoov etablierte ein System für eine Selektion bei hoher
X 400
Vergrößerung, ungefärbte,
Echtzeit hochauflösende Untersuchung
der Organellen von motilen Spermien
Bartoov et al., NEJM 2001
Bartoov et al., J. Androl. 2002
Bartoov et al., Fertil. Steril. 2003
Ergebnisse
ICSI mit abnormalen Spermatozoen: Reduktion der SS-Rate:
20,2% versus 36,7%
Reduktion der Implantationsrate:
9,6% versus 18,7%
Prä-Selektion der Spermien ist essentiell für eine erfolgreiche ICSI
(De Vos et al., Hum. Reprod. 2003)
Spindel(view)analyse
Nicht invasive Darstellung der Spindel mittels
computerassistierter Polarisationsmikroskopie Darstellung der 3 Schichten der Zona pellucida
Metaphase II – Eizellen
Winkel zwischen erstem Polkörperchen
(bei 12:00 Uhr) und meiotischer Spindel
(ca. 30° abweichend) bei einer
menschlichen Eizelle
Kombination von Spindelanalyse & IMSI
Die Kombination könnte zur weiteren Steigerung der
Schwangerschaftsraten bei ICSI führen mit Senkung der
Abortus-Raten – entsprechende randomisierte multi-center
Studien müssen das jedoch noch beweisen
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PICSI
Eine Methode zur Selektion reifer Spermien im Rahmen der
intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Die Picsi-Schale
ermöglicht in nicht invasiver Form die Auswahl von genetisch
integeren, d.h. reifen Spermien durch Hyaluronsäure Spots.
Die Köpfe reifer Spermien tragen eine spezifischen Rezeptor für
Hyaluronsäure (Hyaluronan). Hyaluronan ist eine wesentliche
Komponente der Hülle, welche die Eizelle umgibt. Unreife Spermien
verfügen nicht über diesen Rezeptor
Durch den sogenannten Hyaluronan-Bindungstest werden Spermien
aufgrund von bestimmten Membran-Bindungseigenschaften
selektiert. Alle bindenden Spermien sind reif und zeigen keine DNADegradierung auf. Diese gebundenen Spermien können für die ICSI
verwendet werden.
TUNEL - Test
DNA Fragmentierung von Spermatozoen als prognostischer
Faktor - Analyse z.B. mittels
SCNA - Chromatine Structure Assay
COMET Assay und
TUNEL Assay – dieser Assay misst DNA-Brüche direkt. Eine
terminale Transferase hängt modifizierte Nukleotide an
die 3`OH -Enden der Bruchstelle. Diese Methode ist
sowohl für Lichtmikroskope, wie auch
Fluoreszenzmikroskope geeignet.
Durch erhöhte DNA-Fragmentierung von Spermatozoen
wird die Schwangerschaftsrate bei etwa jedem Paar mehr als
halbiert.
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IMSI und PICSI, sowie der TUNEL-Test erlauben in
bestimmten Fällen eine Verbesserung der Ergebnisse:





Bei fehlender Befruchtung nach ICSI,
bei fehlgeschlagener Implantation,
bei schwerer Teratozoospermie,
bei erhöhter DNA-Fragmentation
und vielleicht auch
bei idiopathischer Infertilität?
Es fehlen derzeit Daten aus Studien mit Evidenzklasse I und II
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Embryonale Entwicklung - Hatching
1 Zona pellucida
2 Trophoblast (äussere Zellmasse)
3 Hypoblast (Teil der inneren
Zellmasse)
4 Blastozystenhöhle
5 Epiblast (Teil der inneren
Zellmasse)
Blastocyste
„hatching“
Die Blastozyste schlüpft aus der teils aufgelösten Membrana pellucida. Man
unterscheidet den Trophoblasten, der die äußere Zellmasse bildet und den
Embryoblasten (innere Zellschicht mit Epi- und Hypoblasten) sowie die
Blastozystenhöhle. Erst nach dem Schlüpfen aus der Zona pellucida kann der
Embryo direkt mit dem Endometrium in Kontakt treten.
Erfolgsfaktor Assisted Hatching
„Hatchende“ Blastocyste
Klare Aussage!
Definitiv wird die Schwangerschaftsrate
erhöht bei Frauen...
mit mehreren Misserfolgen bei IVF/ICSI
mit reduzierter Prognose
OR 1,33 (95% CI 1,12 bis 1,57)
Beispiel: von 25% auf 28% bis 39%
Auch die Mehrlingsrate steigt.
Seif MMW, Edi-Osagie ECO, Farquhar C, Hooper L, Blake D, McGinlay P. Assisted
hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database of Systematic
Reviews 2006, Issue 1. Art. No.: CD001894.
23 Studien mit guter Qualität und 2889 Frauen mit 954 Schwangerschaften
Jelinkova L, Pavelkova J, Strehler E, Paulus W, Zivny J, Sterzik K. Improved
implantation rate after chemical removal of the zona pellucida. Fertility and Sterility
2003;79 Suppl 6:1299-1303.
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Präimplantationsdiagnostik
Preimplantation
Genetic Testing
(PGT)
Preimplantation
Genetic Diagnosis
(PGD)
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Preimplantation
Genetic Screening
(PGS)
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Polkörperdiagnostik (PKD)
Entfernung eines/mehrerer Nuclei von
Oozyten (Polkörperchen) oder
Embryonen (Blastomere/Trophektoderm)
Untersuchung einer mütterlichen genetischen oder
chromosomalen Veränderung des haploiden weibl.
Chromosomensatzes durch die Untersuchung es ersten
und zweiten Polkörper im Ablauf einer IVF/ICSI –
indirekte Diagnostik einer Eizelle
Testung auf
Mutationen von Gensequenzen
Aneuploidie
Polkörperdiagnostik (PKD)
Gilt als ein in Erprobung befindliches Verfahren
Indikationen:
 Erkennung eines spezifischen genetischen,
einschließlich chromosomalen kindlichen Risikos
mittels indirekter Diagnostik der Eizelle
 Erkennung unspezifischer chromosomaler Risiken
im Rahmen von IVF zur möglichen Erhöhung der
Geburtenrate – bisher in der Literatur sehr
kontroversiell beurteilt, nach letzten Studien
Vorteil eher nicht gegeben
Polkörperdiagnostik (PKD)
 Die PKD ist an die Anwendung an eine IVF/ICSI
Behandlung geknüpft, auch wenn keine Fertilitätsstörung
vorliegt
 Nachdem diese Untersuchung vor Bildung eines Embryos
durchgeführt wird, ist das Embryonenschutzgesetz davon
nicht berührt
 Nur Veränderungen ♀ können damit festgestellt werden
 Die Untersuchung am 2. Polkörperchen gelingt nicht mmer
FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22
Was bringt PGD wirklich?
PGD bei fortgeschrittenem mütterlichen Alter
Die Wirksamkeit der Präimplantationsdiagnostik (PGD) bei
Frauen mit "fortgeschrittenem Alter" wurde vorausgesetzt,
ohne in RCTs überprüft zu sein.
Die neue große Multizenterstudie findet nun keinen Vorteil der
PGD, sondern ganz im Gegenteil, signifikant weniger
Schwangerschaften (ongoing) und Lebendgeburten als bei
Verzicht auf die Diagnostik.
Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al.
In vitro fertilization with preimplantation genetic screening.
N Engl J Med 2007;357:9-17
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Durchführung eines Blastozystentransfers (BcT)
abhängig von
 Alter der Frau
 Anzahl der Oocyten
 Qualität der Oocyten
 Qualität der kommerziell erhältlichen
Medien
 nicht bei poor Respondern
(keineVerbesserung der Ergebnisse)
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Vorteile der Blastozystenkultur
 Gewinnung der besten lebensfähigen Embryonen nach
Überwindung der Entwicklungsblockade in den in vitro
Kulturen zwischen Tag 2-3 (4-8 Zellstadium)
 Bessere physiologische Bedingungen und Synchronisation
zwischen Endometrium und Embryo-Entwicklungsstadium
 Im 2-4 Zellstadium ist die Zona pellucida durch die
Kulturbedingungen in vitro so verhärtet, dass es nur
schwer zum Hatchen kommt
 Völlige Entfernung der Zona pellucida mit enzymatischen
Methoden und Transfer von zona pellucida freien
Blastozysten für eine bessere Implantation (Eine
Möglichkeit in der Zukunft?)
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Methoden der Kryokonservierung
„slow cooling“ – langsames Einfrieren mittels
computergesteuerten Freezingapparaten (z.B. –
0,30C/min., bei niedrigen Kryoprotektiva ~10%)
Vitrifikation – ultraschnelles Abkühlen > -10.000oC/min
wobei die Zellen direkt in einen amorphen Zustand
(Verglasung) übergehen (Martino et al., 1996)
Anwendung im medizinischen Bereich
Reproduktionsmedizin
 Fertilitätsprophylaxe
 Stammzellforschung
Methode der aseptischen Vitrifikation
Relativ langsames
Abkühlen (-600oC/min)
Ultraschnelles Erwärmen
(6.000oC/min)
Parallel Entfernung der
Kryoprotektoren
Kein Risiko einer
Kontamination
Isachenko V, Montag M et al., Human Reproduction, 2005
Zusammenfassung
Vitrifikation ist die Methode für
 Germinal Vesikel Eizellen
 Metaphase-II-Eizellen (Eizellspende)
 Blastozysten
 Ovargewebe ?
Kommerzielle Medien verfügbar – Asept. Vitrifikation ist möglich
Andrologie:
 Kryokonservierung ist fester Bestandteil zur Fertilitätserhaltung
Gynäkologie:
 Kryokonservierung erhöht die kumulative Schwangerschaftsrate bei IVF/ICSI
 Kryokonservierung nach in-vitro Maturation ist derzeit eher
umstritten (ethisch/biologisch)
Onkologie:
 Kryokonservierung primär zur Autotransplantation und
Hormonsubstitution, sekundär zur Fertilitätserhaltung
Zukunftsaspekte in der ART
 Eizell- Embryo- und Samenbanken
 Selektion durch Präimplantationstechniken?
 Ovarian tissue banking (OTB)
 In vitro maturation (IVM)
 Autologe Ovartransplantation nach Kryopreservation
 Schwangerschaften in den Wechseljahren mit Hilfe
kryokonservierter Eizellen (aktuell durch starken
Anstieg der Lebenserwartung!)
Zukunftsaspekt - Ovarian Tissue Banking
 Grosse Anzahl an Primordialfollikeln im Gewebe
vorhanden  höhere Erfolgschancen?
 Keine Stimulation, dafür aber LSK notwendig
 Kurzfristig durchführbar (Op. Freigabe)
 Natürliche Empfängnis denkbar
 Als autologe Hormonersatztherapie denkbar
______________________________________________________
Ovarielle Gewebeentnahme Bestrahlung/Chemotherapie/OP

Retransplantation des ovariellen Gewebes
Ovarian Tissue Banking - Einschlusskriterien
Primäres Kriterium: Erhaltung der Fertilität
- Altersgrenze: ca. 35 - 37a
- FSH < 10
- LSK möglich
- Keine anamnestische Bestrahlung
- Frühes Stadium der Chemotherapie
Ganzes Ovar oder Teilovarektomie?
Ovarektomie:
Lokale oder Ganzkörperbestrahlung
Tangentiale Resektion:
Chemotherapie ohne Bestrahlung
In-vitro-Maturation (IVM)
Gewinnung von Ovargewebe
Isolierung von unreifen Oozyten
(Primordialfollikel, Primärfollikel)
künstliche Reifung (FSH / HCG)  IVF/ICSI-Therapie
In-Vitro-Maturation bisher nur im Mausmodell gelungen
(Smitz et al., Hum Reprod, 1999)
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Erfolgsfaktor IVM?
IVM ist die in vitro Reifung der Oocyten vom GV-Stadium zum
Metaphase II Stadium
IVM-Methodik: Aspiration unreifer Oocyten in nicht oder niedrig
dosiert stimulierten Zyklen
In vitro Maturation (IVM) ist bisher wenig untersucht in RCTs.
Keine valide Aussage aus prospektiv kontrollierten Vergleichstudien
zum Erfolg gegen „normale IVF“ möglich.
Priming mit FSH/hMG oder unstimuliert punktieren?
Mit oder ohne hCG Gabe?
Diese Fragen sind nicht zuverlässig beantwortet.
Hesham Al-Inany. Female infertility. Clinical Evidence 2005
„Future Perspectives“
Prophylaktische bilaterale Ovarektomie bei
Risikopatientinnen (z.B. BRCA 1 & 2) aber
auch OTB bei erst späteren Kinderwunsch
ohne Erkrankung
dadurch Erhaltung der
Fertilität bei möglichen
spätem Kinderwunsch
Vorsorgliche Einlagerung zur
späteren biologischen HRT ev.
anti aging bzw. „better aging“
Therapie

Moderne_Reproduktionsmedizinische_Techniken_Gran_Canari