Lipid rafts und ihre Funktion
in biologischen Membranen
Seminar Biotechnologie 1
Lisa Marie Finkler
SS 2012
Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt
1
Gliederung

Biologische Membranen




Lipid Rafts


Aufbau
 Membranlipide
 Membranproteine
Funktionen einer biologischen Membran
Fluid Mosaic Modell
Funktionen von Lipid Rafts
Ergebnisdarstellung


„Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of
erythrocyte lipid rafts“
“Ca++-dependent viscle release from erythrocytes involves
stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin”
2
Biologische Membranen

Grenze zwischen 2 Kompartimenten
 Intrazellulär (innerhalb einer Zelle)
 Interzellulär (Inneren einer Zelle zu Zellaußenraum)

Selektiv permeabel

Bestehen hauptsächlich aus:
 Lipiden
Anteil ist je nach Membrantyp
 Proteinen
unterschiedlich
3
Aufbau einer biologischen Membran
[1]
4
Aufbau einer biologischen Membran


Membranlipide bilden die Grundstruktur (Doppelschicht)
Amphiphatisch


Hydrophiler Kopf
Lipophiler Kohlenwasserstoffrest

Permeabilitätsschranke

Phospholipide
Sphingolipide
Cholesterin


Mizelle Lipiddoppelschicht Liposom [2]
5
Aufbau einer biologischen Membran

Phospholipide
Phosphatidylcholin
(siehe Abbildung)
 Phosphatidylserin
 Phosphatidylethanolamin
 Phosphatidylinositol

häufigste Membranlipide
[3]
6
Aufbau einer biologischen Membran

Sphingolipide
„Signalübertragung, Interaktion zwischen einzelnen
Zellen, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelltod“ [6]
[4]
7
Aufbau einer biologischen Membran

Cholesterin
Steroid-Grundgerüst
 Hydrophiler Anteil (OH-Gruppe)
 Membranoberfläche

Hydrophober Rest
 Innerhalb der Membran

Gehalt an Cholesterin
beeinflusst die Fluidität
der Membran
[5]
8
Aufbau einer biologischen Membran
Membranproteine
Integrale
Membranproteine
(1-3)
Periphere
Membranproteine
(4)
Lipidverankerte
Proteine
(5)
[6]
9
Aufbau einer biologischen Membran

Integrale Membranproteine

Amphiphatisch
Hydrophober Anteil innerhalb der Membran
Verankerung durch Wechselwirkung mit Fettsäureketten
 Hydrophiler Anteil außerhalb der Membran
Wechselwirkungen mit der Umgebung


Periphere Membranproteine


Nichtkovalente Bindungen an Membran bzw. Proteine
Lipidverankerte Proteine

Kovalente Bindung an ein Lipid (z.B.: GPI-Verankerung)
10
Funktionen einer biologischen Membran

Kompartimierung

Selektive Permeabilität

Transportvorgänge

Signalaufnahme, Weiterleitung, Abgabe

Ort der Energie- sowie Stoffumwandlung
(Träger von Enzymen)
11
Fluid Mosaic Modell


1972 S.J. Singer und G.L. Nicolson
[7]
Modell zum Aufbau der biologischen Membran
Flüssig-kristalline Lipiddoppelschicht
(Hydrophile „Köpfe“ der Membranlipide  außen,
Hydrophobe „Fettsäureschwänze“  innen)
 Membranproteine inselartig eingelagert, lateral frei beweglich

dynamische Struktur
12
Fluid Mosaic Modell

Membranfluidität



Lipidzusammensetzung
Cholesterinanteil (hoher Anteil  erhöhte Viskosität)
Temperatur
[8]
Stabilität durch hydrophobe Wechselwirkungen
zwischen den Fettsäureketten
Wärmezufuhr: Übergang von kristallinem zu flüssigkristallinem Zustand
13
„Lipid Rafts“- Lipidflöße
[9]
14
„Lipid Rafts“- Lipidflöße

Unterscheiden sich in
ihrer Zusammensetzung
von anderen
Membranbereichen





Sphingolipide
Cholesterin
Glycolipide
GPI-verankerte Proteine
Stärker geordnet und
dichter gepackt

Caveolae


Ausbuchtungen der
Membran
Caveolin als wichtigste
Strukturelement
hochdynamische
Strukturen
Zusammenlagerung
Auflösung
15
Funktionen von Lipid Rafts
[8]
16
Funktionen von Lipid Rafts
[9]
17
Ergebnisdarstellung

„Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral
proteins of erythrocyte lipid rafts“
von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143)
Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Lipid Rafts

Verwendete Methoden
 Isolation der Lipid Rafts aus Erythrozyten durch Extraktion
 Gelektrophorese, Silberfärbung
 Membranmarker: Acetylcholinesterase (AChE)
 Western Blot
18
Ergebnisdarstellung
A: diskontinuierliche
Dichtegradientenzentrifugation
(Spur 1: Pellet, Spur 2: hohe Dichte,
Spur 3: mittlere Dichte, Spur 4: Lipid Rafts)
B: Extraktion in alkalische Lösung
(Na2CO3)
(Spur T: Suspension vor Extraktion,
Spur S: Überstand, Spur P: Pellet)
Stomatin, Flotillin-1 und -2
 Integrale lipid raft assoziierte
Membranproteine
 Protein 4.1 und 4.2, Spectrin, Actin
 Periphere Membranproteine

Methode A
Methode B
19
Ergebnisdarstellung


Immunblot der isolierten Lipid
Rafts
Oligomere Komplexbildung von
Flotillin-1 und -2 sowie Stomatin
Spur 1 und 2: Erythrozytenmembran
eines OHSt krankem Patienten;
Spur N: gesunde Person
 Stomatin ist nicht in Spur 1 und
2 nachweisbar (OHSt)
OHSt: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis
20
Ergebnisdarstellung

“Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes
involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin
VII), and sorcin”
von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer
Prohaska; blood (2002 99: 2569-2577)
Erkenntnisse über die Bestandteile von Lipid Rafts
sowie über die calciumabhängige Vesikulation

Verwendete Methoden
 Rasterkraftmikroskopie
 Calciumabhängie Vesikulation
 Trennung der Mikro- und Nanovesikel durch Zentrifugation
 Gelektrophorese, Silberfärbung
 Western Blot
21
Ergebnisdarstellung
Methode A und B unterscheiden sich
Zentrifugationsmethoden
A)
B)



Spur 1: Erythrozytenmembran
Spur 2: Mikrovesikel
Spur 3: Nanovesikel
Spur 1: Erythrozytenmembran
Spur 2 und 3: Mikrovesikel
Spur 4: Nanovesikel
Stomatin in Mikrovesikel
Synexin und Sorcin in Nanovesikel
Carboanhydrase ( CA) und
Hämoglobin (Hb) in beiden
nachweisbar
22
Ergebnisdarstellung
A sowie B: Auswirkung von Ca2+
bzw. EDTA-Zugabe
S: Überstand; P: Pellet
nach Zentrifugation
aq: aquatisch; dt: detergent
nach Phasenseperation



Synexin und Sorcin nach Ca2+
Zugabe im Pellet, nach EDTA
Zugabe im Überstand
Stomatin: keine Auswirkungen
Stomatin nach
Phasenseperation durch
Triton X-114 nur noch in der
detergenten Phase
23
Ergebnisdarstellung

Periphere Membranproteine



Integrales Membranprotein,
Cytoskelettanker
beteiligt am Kationentransport
(Na+/K+)
 Abwesenheit: Overhydrated
Hereditary Stomatocytosis

Durch hydrophobe
Wechselwirkungen oder
Wasserstoffbrückenbindungen
an Membran gebunden
 Ablösen durch Veränderung
des pH-Wertes, des Puffers,
der Salzkonzentration (EDTA)


Synexin

Peripheres, calciumbindendes
Protein
 Exozytoseprozesse,
Membranfusion
Integrale Membranproteine

Stomatin
Ablösen durch Detergenz
(Triton X-114)

Sorcin

Peripheres, calciumbindendes
Membranprotein
 Signaltransduktion
24
Abbildungsverzeichnis
[1] http://www.biokurs.de/skripten/bilder/membr3.jpg
[2] Biochemie: Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten
von Philipp Christen,Rolf Jaussi, Springer (2005)
[3] www.chemgapedia.de
[4] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelin
[5] http://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.html
[6] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan
Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005)
[7] http://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singerand-Nicholson-resized-150x150.jpg
[8] http://www.uni-marburg.de/fb20/cyto/lehre/Jacob/membranen.pdf
[9] Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas
Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011)
[10]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html
[11]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html
25
Quellen
[1] Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3.
Auflage (2010)
[2] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan
Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005)
[3]http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/transport/membranentrans
port.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/transport/membran_aufbau_funktion.vscml.html
[4] http://de.wikipedia.org/wiki/Lipide#Membranbildende_Lipide
[5] www.lipidsignalling.de/lipidimfocus/sphingolipide.php
[6] Biochemie von H. Robert Horton,Laurence A. Moran,K. Gray Scrimgeour,J. David
Rawn,Marc D. Perry, Pearson Studium, 4. Auflage (2008)
[7] Biochemie Zellbiologie von Katharina Munk, Thieme (2008)
[8] Kurzlehrbuch Histologie von Norbert Ulfig, 3. Auflage, Thieme (2003)
[9] Molekulare Zellbiologie von Gerald Karp,Sebastian Vogel,Susanne Kuhlmann-Krieg,
Springer, 4. Auflage (2005)
[10]www.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../9783804721074_p.pdf
[11]http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304
[12]Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas
Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011)
[13]http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a004697.full
[14]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html
[15]http://www.fwf.ac.at/de/abstracts/abstract.asp?L=D&PROJ=P15486
[16]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html
[17]http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907
26
[18]http://www.uniprot.org/uniprot/P20073

Funktionen von Lipid Rafts