Immunologie
in der Labormedizin
Konteptvorlesung 2
Themenblock 8
Beda M. Stadler
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KV2 im Überblick
Lernziele: Immunologie in der Labormedizin
• Was sind Immunassays?
• Was versteckt sich hinter
den Abkürzungen?
• Assay Beispiele um
immunologische
Prinzipien zu vertiefen
• Aussagekraft von
Labordaten
• Vertrauensgrenzen
KV 8.2
2
Was ankreuzen?
KV 8.2
3
KV3 im Überblick
Immunologie in der Labormedizin
• Präzipitationsteste
• Agglutinations Teste
• Antigen-Antikörper Teste
•
•
•
•
•
Allgemein
Allergie Diagnostik
Flowzytometrie
HLA Diagnostik
Autoimmun Diagnostik
• Sensitivität und Spezifität von Labortesten
KV 8.2
4
Immunodiffusion
(Ouchterlony Gel)
1
6
1
2
6
2
3
5
3
4
Keine Identität
Identität
A
Antigen
1
Kontrollserum
2
Testserum
2
A
4
KV 8.2
6
A
A
5
1
5
3
4
Partielle
Identität
5
Präzipitinkurve
B
A
C
Anti-B
+
Anti-A
Antigen
Anti-C
Antikörper
Immunkomplex
Immunkomplex
Äquivalenz
Prozone
Postzone
Antigen
KV 8.2
6
Radiale Immunodiffusion
Antikörper im Gel
Ag
Ag
Ag
Diameter2
Ag
AK Konzentration
KV 8.2
7
Serum Elektrophorese
gamma
Globuline
beta
alpha2
alpha1
Albumin
+
KV 8.2
Paraproteinämie-Patient
8
Immun-Elektrophorese
Normales Serum
Albumin
Transferrin
IgM IgA IgG
+
-
Antikörper gegen
Serumproteine
Patienetenserum
mit IgA Mangel
KV 8.2
Beispiel
9
Direkter Coombs Test
KV 8.2
10
Der indirekte Coombs Test
Step 1

+
Patienten
Serum
Erythrozyten
Step 2
+

Coombs Reagens
(Antiglobulin)
z.B. anti-RhD Antikörper
KV 8.2
11
Passive Hämagglutination
(Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)
KV 8.2
12
Latex Agglutination
KV 8.2
13
Blutgruppenbestimmung: Geltechnik
monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A
Antigen in der oberen Gelmatrix
Resultat: Blutgruppe A RhD neg
KV 8.2
14
z.B. Schwangerschaftstest
rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens
Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase)
Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)
KV 8.2
15
Allergieserologie: welcher Test?
Referenzbereich
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
Anti-b2-Glycoprotein 1 (IgG)
ELISA
U/ml
<15
Cardiolipin-Antikörper (IgG)
SYNELISA
GPL-U/ml
<12
ECP ("eosinophil cationic protein")
FEIA
g/L
2.5-15
Tryptase
FEIA
g/L
1-13.5
Methylhistamin
RIA
µg/g Kreatinin
70-160
Total IgE
FEIA
kIU/L
Allergen-spezifisches IgE
(RAST)
Allergen-spezifisches IgG
FEIA
Rastklassen 0-6
FEIA
mg/L
Präzipitine
Immundiffusion
qualitativ
KV 8.2
(altersabhängig)
0
< 50 mg/L
negativ
16
KV 8.2
17
Immun Assay: RIA & ELISA
Isotop
• Radio
• Immuno
• Assay
Enzyme
markierter
Antikörper
Antigen
Antikörper
•
•
•
•
•
Enzyme
Linked
Immuno
Sorbent
Assay
Messung der
Radioaktivität
oder
Enzymaktivität
KV 8.2
18
ELISA
Markierter Antikörper
Substrat
Enzym
Anti-A
Produkt
A
KV 8.2
19
Sandwich ELISA
Anti-Antikörper
Substrat
Enzym
Anti-A
Produkt
A
KV 8.2
20
Standardisierung
KV 8.2
21
Beispiel: Flowzytometrie
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
HLA-B27
Zytofluorometrie
qualitativ
positiv/negativ
Lymphozyten
Zytofluorometrie
Zellen/l
1200-2800
CD3 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
690-2540
55-84
CD4 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
410-1590
31-60
CD8 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
190-1140
13-41
NK-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-590
5-27
B-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-660
6-25
KV 8.2
Referenzbereich
22
FACS
sample
nozzle
sheet flow
red fluorescence
prism
green fluorescence
laser
Fluorescence
Activated
Cell
Sorter
right angle scatter
forward scatter
sorted cells
KV 8.2
23
Zellpopulationen
• Link
alle CD Marker
?
KV 8.2
24
CD-Antikörper
CD
Antigen
Funktion
Vorkommen
CD 2
Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer
Aktivierungsweg von T-Lymphozyten
unreife und reife T-lymphozyten
CD 3
T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten,
reife T-Lymphozyten
Signaltransduktion
CD 4
assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an
T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen
MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor
CD 8
Bindung an MHC-Klasse I Moleküle
zytotoxische T-Lymphozyten
CD 14
Rezeptor für bakterielles Endotoxin
(LPS=Lipopolysacharid)
Monozyten, Makrophagen
CD 16
Fc-gamma Rezeptor III
NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen,
Makrophagen
CD 23
niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE
B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC)
CD 25
Interleukin-2-Rezeptor
aktivierte T-Lymphozyten
IgM
Antigenrezeptor
unreife + reife B-Lymphos
IgD
Antigenrezeptor
reife B-Lymphos
HLA-DR
MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von
Antigenpeptiden
AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen,
Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos
KV 8.2
25
Eine Immunantwort verfolgen
KV 8.2
26
CD-Marker bei der Diagnose von
lymphohämopoietischen Erkrankungen
Stammzelle
ALL
Prä-B.
frühe B.
mittlere B.
reife B.
plasmozytoide B.
Plasmazelle
PLL, Burkitt
Lymphom
CLL,
foll. L.
HaarzellL.
Waldenström
Myelom
CD19
CD 20
CD 34
CD 52
CD13
8
KV 8.2
27
Beispiel: HLA Typisierung
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
HLA-B27
Zelllyse
qualitativ
positiv/negativ
HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch)
Zelllyse
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ I (A, B)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DR)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DQ)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DP)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ Organempfänger
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
T-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
B-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
Leukozytenantikörper
Zelllyse
qualitativ
negativ
KV 8.2
Referenzbereich
28
HLA Typisierung einst...
KV 8.2
29
Überlebensrate Nierentransplantate
Number of HLA mismatches
A&B
0
KV 8.2
DQ & DR
0
A&B
3 or 4
DQ & DR
1 or 2
30
HLA-B27 Typisierung mittels FACS
KV 8.2
31
HLA Typisierung serologisch
KV 8.2
32
PCR
KV 8.2
33
HLA: Molekulare Diagnostik
KV 8.2
34
Array Technologie
„DNA Chips“
KV 8.2
35
Western Blot: Prinzip
KV 8.2
36
HIV: Western Blot
KV 8.2
1.
Lane 1, HIV+ serum
(positive control)
2.
Lane 2, HIV- serum
(negative control)
3.
Lane A, Patient A
4.
Lane B, Patient B
5.
Lane C, Patient C
37
Beispiel: Autoimmunserologie
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
Rheumafaktor
Nephelometrie
IU/ml
< 20
Zellkerne (ANA)
IIF
Titer
< 1:80
Thyreoidea Thyroglobulin
Agglutination
Titer
< 1:400
C1-Esteraseinhibitor (funktionell)
Fotometrie
% des Normwertes
70-130%
C1q-tragende Immunkomplexe
ELISA
g/ml
Hautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
Schleimhautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
KV 8.2
Referenzbereich
< 35
38
Nephelometry
KV 8.2
39
Immunfluoreszenz
Antinukleäre Antikörper (ANA)
Fluorochrom
markierter AK
Ag
Gewebe
KV 8.2
40
Maus Lymphknoten gefärbt mit einem
anti-T-Zell Antikörper
KV 8.2
41
In situ Hybridisierung
KV 8.2
42
FISH
KV 8.2
43
FISH Beispiel
Fluorescent in situ
hybridisation of a
small intestinal biopsy
in a case of Whipple's
disease (confocal laser
scanning microscopy).
Tropheryma whipplei
rRNA is blue, nuclei of
human cells are green
and the intracellular
cytoskeletal protein
vimentin is red.
Magnification
approximately 200 x.
KV 8.2
44
Immunhistochemie
Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink)
in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody
against cytokeratin (green)
KV 8.2
45
Sensitivität und Spezifität
• Sensitivität (epidemiologisch)
• Sensitivität (analytisch)
• niedriger Titer
• Serokonversion
• Verdünnung
KV 8.2
46
oder...
• Sensitivität = Wahrscheinlichkeit,
dass Test bei kranken Personen
positiv ausfällt
• Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass
Test bei gesunden Personen negativ
ausfällt
KV 8.2
47
Genauigkeit der Labordiagnostik
echt Positive
Sensitivität =
X 100%
echt Positive + falsch Negative
echt Negative
Spezifität =
X 100%
echt Negative + falsch Positive
KV 8.2
48
Aussagekraft der Labordiagnostik
positiver
prädiktiver Wert =
negativer
prädiktiver Wert =
KV 8.2
echt Positive
X 100%
echt Positive + falsch Positive
echt Negative
X 100%
echt Negative + falsch Negative
49
Prädiktive Werte
Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%
• Population #1, die Prävalenz der Infektion ist hoch
• Population: 1000 Seren getestet
• 50 Seren von infizierten Individuen
• 950 Seren von nicht infizierten Individuen
• Test Results: 50 positive:
• 45 aus der infizierten Gruppe
• 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe
• Der positive prädiktive Wert ist:
PPV = 45/ 45+5 = 90%
• 9 von 10 positiven Resultaten sind von infizierten
Individuen
KV 8.2
50
Prädiktive Werte
Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%
• Population #2, die Prävalenz der Infektion ist tief
• Population: 1000 Seren getestet
• 7 Seren von infizierten Individuen
• 993 Seren von nicht infizierten Individuen
• Test Results: 7 positive:
• 2 aus der infizierten Gruppe
• 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe
• Der positive prädiktive Wert ist:
PPV = 2/ 2+5 = 28.6%
KV 8.2
51
KV2 im Rückblick
Immunologie in der Labormedizin
• Traditionelle Serologie
• Moderne
immunologische Teste
• Molekularbiologische
Methoden
• Outlook: Point-of-care
testing ?
Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004
„Ein Einblick in die Labormedizin“
http://www.immunology.unibe.ch/teaching/Praktikum/praktikum.htm
KV 8.2
52

negativ