Diagnostik von Pockenviren
Bund-Länder-AG
„Szenarien bioterroristischer
Anschläge und
Abwehrmaßnahmen“
Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts
06/01/2004
1
Gliederung
•
•
•
•
Einleitung
klinisches Bild
Eingruppierung des Erregers der Pocken
Diagnostik und Differentialdiagnostik
– Elektronenmikroskopie
– Nachweis von Nukleinsäuren
– Erregeranzucht
• Probenahme und Versand
• Diagnostik aus Patientenmaterial und aus
Umweltproben
• Liste der Laboratorien zur Pockendiagnostik
2
Pocken
• Erreger: Variola-Virus
• Inkubationszeit 12 bis 14 Tage (7 - 19 Tage)
• Hohe Viruskonzentrationen in Vesikeln
und Krusten
• Übertragung über Tröpfchen, hohe
Viruskonzentration in Saliva
• Letalitätsrate ca. 30 % (Variola major)
bzw. ca. 1 % (Variola minor)
3
Pocken als Biowaffe
1754/67 Briten „schenkten“ Indianern
in Nordamerika Pockenvirus-verseuchte
Decken
> 50% der Mitglieder der betroffenen
Stämme starben
4
Pocken - klinisches Bild
Tag 3
Tag 5
Tag 7
5
Klassifizierung von
Chondropockenviren
(Pockenviren der Vertebraten)
Orthopoxviren
Avipoxviren
Capripoxviren
Leporipoxvirus
Parapoxvirus
Suipoxvirus
Molluscipoxvirus
Yatapoxvirus
Variola, Vaccinia, Affenpocken, Kuhpocken,
Kamelpocken
Geflügelpocken, Kanarienpocken
Ziegenpocken, Schafspocken, Lumpy Skin
Disease
Myxomatose
Orf, Pseudokuhpocken
Schweinepocken
Molluscum contagiosum
Tanapocken, Yabapocken
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Orthopockenviren
Virus
Variola
Vaccinia
Affenpocken
Kuhpocken
Kamelpocken
Ectromelia
Waschbärpocken
Wühlmauspocken
Uasin-Gisha-Pocken
Taterapocken
Infektionen bei
Wirtsbereich
Mensch
eng
Büffel, Kuh, Mensch, Schwein,
breit
Kaninchen, natürlicher Wirt?
Menschenaffen, Affen, Mensch
breit
natürlicher Wirt: Eichhörnchen (?)
Karnivoren, Kuh, Mensch, Ratte
breit
natürlicher Wirt: Gerbils, Nagetiere (?)
Kamel
eng
Mäuse, natürlicher Wirt (Wühlmäuse?) eng
Waschbär (racoon)
breit?
Wühlmäuse (vole)
eng
Pferd, natürlicher Wirt?
mittel
Tatera kempi (Gerbilart)
eng
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Übersicht über die
Laboruntersuchungen
• Elektronenmikroskopie
– orientierende Schnelldiagnostik (ca. 30 min.)
– Unterscheidung zwischen Herpesviren, Para- und
Orthopockenviren
• Nachweis von Nukleinsäuren/Sequenzierung
– Unterscheidung zwischen verschiedenen
Orthopockenviren (innerhalb von 24 h)
• Virusanzucht
– Nachweis der Vermehrungfähigkeit
(Asservierung für weitergehende Untersuchungen)
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EM-Differenzierung
von Pockenviren und Herpesviren
Herpesvirus
Orthopockenvirus
Parapockenvirus
Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom
9
EM-Differenzierung
Verschiedene Aspekte der Orthopockenviren (OPV)
OPV: mit Virushülle
OPV: M-Form
OPV: M-Form+C-Form
Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom
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Elektronenmikroskopie
• Fixierung des Probenmaterials
(z.B. mit 4 % Formaldehyd in 0,05 M HEPES-Puffer pH
7,0 oder PBS)
• Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens
(z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % NatriumHypochlorid oder 2 % Peressigsäure)
• Negativkontrastierung
(stabile, stark adhäsive Trägernetze; als Kontrastmittel
parallel Phosphorwolframsäure und Uranylazetat oder
Ammoniummolybdat)
11
Elektronenmikroskopie
Aufarbeitung von Proben für den Versand
• Probenahme durch den
verantwortlichen Arzt (1, 2)
• Pockenbläschen mit Schere,
Pinzette o.ä. öffnen (1) bzw.
Schorf mit Pinzette
entnehmen (2)
• Vesikelprobe auf Objektträger,
direkt oder mit Tuberkulinspritze (1)
• Lufttrocknen (1, 2)
• Inaktivierung (1, 2)
• bruchsicherer Container (1, 2)
• Sterile Umverpackung (1, 2)
1 Versand von Vesikelflüssigkeit
2 Versand von Vesikeln / Schorf
Quelle Fotos: RKI
Quelle: RKI
12
Elektronenmikroskopie
Aufarbeitung von Proben für den Versand - Grid-Methode
• EM-Trägernetz mit dunklen
„Ober“- Seite für 2-3 sec auf
die Bläschenflüssigkeit
abdrücken, pro Läsion 2-3
Grids
• Lufttrocknen in der Pinzette
• Inaktivierung mit 4%
Formaldehyd in PBS oder
HEPES-Puffer
• Versand:
- beschriftetes Röhrchen
- sterile Umverpackung
Quelle Fotos: RKI
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Nachweis von Nukleinsäuren
• Inaktivierung des Probenmaterials
(z.B. mit Lysispuffer 25-50 % Guanidiniumchlorid)
• Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens
(z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid
oder 2 % Peressigsäure)
• Probenaufbereitung/Isolierung der DNA
(Protease, AL-Puffer)
• Nachweis von Nukleinsäuren
– Consensus PCR (Vertreter der Orthopoxviridae OPV)
– Differenzierung des Variola-Virus von anderen OPV
(Sequenzierung z. B. crmB-Gen, ATI-Gen, HA-Gen oder
validierte Varila-spezifische PCR )
14
Erregeranzucht
• Nur aus nicht-inaktiviertem Probenmaterial
• Nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4
(BSL4)
• Eine Differenzierung erfolgt nach Präparation
der Virus-DNA über PCR mit Sequenzierung
und phylogenetischer Analyse
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Gewinnung klinischer Proben
Zusammenfassung der Möglichkeiten zur Probenahme:
EM: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % FA
2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% FA
3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % FA
4) Direkter Abklatsch (Grid) fixiert mit 4 % Formaldehyd
PCR: Aliquot in Reaktionsröhrchen (in einer Glove-Box)
Benötigtes Material zur Probenahme:
•
Schutzausrüstung
•
Pinzette, Schere, Spritze, Objektträger, Grid (je nach Technik)
•
Versandröhrchen (z.B. Einfrierröhrchen)
•
Stoßsichere, auslaufsichere Umverpackung (mit Beipackzettel)
Zur Fixierung/Desinfektion :
•
4 % Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer (EM)
•
Lysispuffer AL, Puregene Kit, o. ä. (PCR)
•
Desinfektionsmittel zur Außendekontamination
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Gewinnung von Umweltproben (1)
• Probenahme durch Einsatzkräfte (z.B. Feuerwehr)
• Sicherstellung, dass kein explosiver Stoff / kein
chemischer Kampfstoff enthalten ist
• Risikoanalyse:
– Fall 1: geschlossenes Behältnis
– Fall 2: geöffnetes Behältnis (a) Feststoff, (b) Pulver, (c) Flüssigkeit
– Fall 3: Freisetzung
•
•
•
•
•
Schutzkleidung anlegen
Probenahme
Außendesinfektion des Probenahmegefäßes
Stoßfeste Umverpackung
Beschriftung der Umverpackung
(Fundort, Datum, Uhrzeit)
17
Gewinnung von Umweltproben (2)
• Schwarzbereich: durch Probe kontaminierter Bereich
– Schutzanzug mit positivem Druck
– Raum verschließen
– Desinfektion der Oberflächen (Entscheidung, ob und wann )
• Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse)
– Außendesinfektion des Probenahmegefäßes
– weitere Verpackung des Probenmaterials
– Desinfektion der Schutzanzüge etc.
• Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich
– Betreten nur nach Desinfektion der Schutzkleidung
– Nur steril verpackte Probe
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Probentransport
• Schnellstmöglicher Probentransport zum Labor
(Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per
Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen.)
• Information des Ansprechpartners im Labor
• Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und
Anforderungen an die Diagnostik
• Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll
(inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten)
• Persönliche Übergabe durch vorab bestimmten Kurier
(Übergabeprotokoll wird momentan erstellt)
• Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das
Labor an den behandelnden Arzt oder zuständigen
Amtsarzt
19
Pockenvirusdiagnostik
Umweltprobe
Klinische Probe
z.B. Rachenabstrich; Blut;
Vesikelinhalt; Krusten
Probenasservierung


Untersuchung im EM
PCR
Negativkontrastierung
(Differentialdiagnose zu VZV)
Orthopockenviren
Orthopocken- und
Variola-spezifische
Primer bzw. Sonden
positiv
beide positiv
Klinische Probe: Verdacht
Umweltprobe:
Verdacht
z.B. Pulver, Erdprobe,
Wasser, Abklatsch etc.
1. Fixierung für EM
2. Inaktivierung für PCR
3. Asservierung für Anzucht
Anzucht in Zellkultur
Differenzierung mit PCR
Sequenzierung
beide positiv
Klinische Probe: bestätigt
Umweltprobe: begründeter Verdacht
Umweltprobe: bestätigt
Vorbereitung von drei Probengefäßen: Die Schritte 1–3 werden bei klinischen Proben direkt bei der
Abnahme von Patienten und bei „Umweltproben“ in einer Glove Box durchgeführt.
Eine Anzucht von Pockenerregern ist nur in BSL-4-Laboratorien möglich. Nach Fixierung bzw. nach
Inaktivierung können die Proben unter BSL-1/-2-Bedingungen weiter bearbeitet werden
.
20
Bewertungskriterien für
Untersuchungen auf humane Pockenviren
in klinischem Material (1)
Verdacht auf Pockenviruserkrankung:
Elektronenmikroskopischer Nachweis eines
Orthopockenvirus aus klinischer Probe
21
Bewertungskriterien für
Untersuchungen auf humane Pockenviren
in klinischem Material (2)
Bestätigt positiv:
Positive Orthopockenvirus-/Variola-PCR aus klinischem Material
und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (validierte
PCR, Sequenzierung)
oder
Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus
klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen
Methoden (PCR, Sequenzierung)
(Anzucht von Pockenviren aus klinischem Material und
Bestätigung von Variola mit validierten molekularen Methoden
(PCR, Sequenzierung))
22
Bewertungskriterien für
Untersuchungen auf humane Pockenviren
in “Umwelt”proben
Verdacht:
Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus
aus einer Umweltprobe
begründeter Verdacht:
PCR positiv für Orthopockenviren bzw. für Variola;
Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden
(PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse)
Bestätigung:
Anzucht von Pockenviren zum Nachweis der Vermehrungsfähigkeit in Zellkultur und Bestätigung von angezüchtetem
Variolavirus mit validierten molekularen Methoden (PCR,
Sequenzierung, Stammbaumanalyse)
23
Vorschlag für Laboratorien
zur Pockendiagnostik
Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin
Prof. Dr. H. Schmitz
Dr. Stephan Günther
20359 Hamburg
BSL 4
Institut für Virologie der Universität Marburg BSL 4
Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk
Dr. Jan ter Meulen / Dr. Stephan Becker
35037 Marburg
Robert Koch-Institut
BSL 3
Konsiliarlaboratorium für EM-Erregerdiagnostik
Dr. Hans R.Gelderblom
Retrovirologie, Prof. Dr. Georg Pauli
13353 Berlin
Niedersächsisches Landesgesundheitsamt
Dr. Matthias Pulz
Dr. Masyar Monazahian
30449 Hannover
BSL 3
Institut für Medizinische Virologie
Prof. Dr. H. W. Doerr
Prof. Dr. Holger Rabenau
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
60596 Frankfurt/Main
Sanitätsakademie der Bundeswehr
Dr. Hermann Meyer
Dr. Finke
Institut für Mikrobiologie
80937 München
BSL 3
BSL 3
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und
Lebensmittelsicherheit Oberschleißheim BSL 3
Dr. Gerbermann
85764 Oberschleißheim
Institut für Medizinische
Prof. Dr. Hans Wolf
Prof. Dr. Wolfgang Jilg
Mikrobiologie und Hygiene
93053 Regensburg
BSL 3
24
Diagnostische EM-Laboratorien
mit überprüfter Expertise*
Institution
Abteilung
LUA Sachsen
Standort Dresden
IZW-Friedrichsfelde
Elektronenmikroskopie
BBGes-ILAT
Institut für Lebensmittel, Arzneimittel
FU Berlin, UKBF
Inst. für Infektionsmed., Abt. Virologie
BgVV
FG 306
Robert-Koch Institut
ZBS 4, Bildgebende Verfahren
LVL Brandenburg
Laborbereich Potsdam
LVL Brandenburg
Laborbereich
BFAV Insel Riems
Bernhard-Nocht-Institut
Elektronenmikroskopie
Universitätsklinikum Kiel
Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Virologie
Wehrwissenschaftliches Institut für Schutztechnologien, Virologie
Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Virologie
Uni Bielefeld
Zentrum für Ultrastrukturelle Diagnostik
Universität Marburg
Institut für Virologie
Justus-Liebig-Uni Gießen
Institut f. Virologie, FB10, VetMed
Justus-Liebig-Uni Gießen
Inst.f.Hyg. u. Infektionskrankh. d. Tiere
Dt. Primatenzentrum GmbH
Abt. Tiermedizin u. Primatenhaltung
LUA Sachsen-Anhalt
Standort Stendal
Univ.-klinikum Münster
Institut f. Medizinische Mikrobiologie
Universität Bonn
Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Immunol.
Zentrales Institut des Sanitätsdienstes d. Bundeswehr, Elektronenm.
LUA, FB Tiermedizin
Inst.f. Tierseuchendiagnostik
Staatl. Veterinäruntersuchungsamt, Diagnostik/ Virologie
Universität Frankfurt/ Main
Institut f. Medizinische Virologie
Paul-Ehrlich Institut
Abteilung 3/3
Uniklinikum
Institut für Anatomie und Zellbioologie
Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten, Inst. für Immunologie
Ludwig-Maximilians-Univ.
Institut f. Medizinische Mikrobiologie
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit
Uni-Klinikum Regensburg
Zentrales EM-Labor, Pathologie
* Expertise geprüft von der DVV
PLZ
1099
10315
10557
12203
12277
13353
14469
15236
17493
20359
24105
29633
30625
33615
35037
35392
35392
37077
39576
48151
53105
56070
56073
59821
60596
63225
66421
72076
80539
85764
93042
Ort
Dresden
Berlin
Berlin
Berlin
Berlin
Berlin
Potsdam
Frankfurt/O.
Greifswald-Insel Riems
Hamburg
Kiel
Munster
Hannover
Bielefeld
Marburg
Gießen
Gießen
Göttingen
Stendal
Münster
Bonn
Koblenz
Koblenz
Arnsberg
Frankfurt/M.
Langen
Homburg / Saar
Tübingen
München
Oberschleißheim
Regensburg
25

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