Planung von Experimenten zur
Sicherheitsforschung bei Gehölzen
W. E. Weber
Institut für Pflanzenzüchtung und
Pflanzenschutz
Martin-Luther-Universität HalleWittenberg
Dahnsdorf, 5. Juni 2003
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Pappel und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
Struktur des Forschungsverbundes
Spezifische Umweltwirkungen transgener Gehölze
Vertikaler
Gentransfer
Sterilitätskonzepte
P1: Espe
P2: Apfel
Rhizosphäre
Rhizosphäre
P4, P5: Pappel
Rebarthropoden
Rebarthropoden
P6: Rebe
Auskreuzung
P3: Rose
Verantwortliche, am Vorsorgeprinzip orientierte
Nutzung gentechnisch veränderter Gehölze
Gehölze, Übersicht über die Projekte
• P1 Espen und P2 Apfel
– Männliche und weibliche Sterilität bzw. Parthenokarpie
sollen vertikalen Gentransfer unterdrücken.
• P3 Rosen
– Quantitative Erfassung des vertikalen Gentransfers
• P4 Pappeln
– Bodensanierung durch transgene Pappeln
• P5 Pappeln
– Einfluss von Transgenen auf die Rhizoflora im Labor und
Freiland
• P6 Wein
– Direkter und indirekter Effekt von Chitinasen und
anderen Enzymen auf Rebarthropoden bei Wein
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Pappel und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
Gehölze sind durch folgende Besonderheiten
gekennzeichnet:
• mehr- bis vieljährig
• große Pflanzen
• langsame Jugendentwicklung bis zur Blüte
• genetisch vergleichsweise wenig untersucht
Generelle Aspekte mit
transgenen Gehölzen
• Der Versuchsansteller ist für viele Jahre
standortmäßig festgelegt.
• Es gibt zahlreiche Wechselbeziehungen zur übrigen
Flora und Fauna.
• Nur eine vergleichsweise kleine Zahl an Pflanzen
kann genauer untersucht werden.
• Ein einmal gewählter Versuchsplan ist kaum noch
zu ändern.
• Partielle Entnahme von Bäumen führt zu Lücken im
Versuchsplan mit allen Konsequenzen.
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Espen und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
P1 Espe - Ziele
• Vermeidung von Auskreuzungen bei
transgenen Espen
– männliche Sterilität => Pollenflug aus der Anlage
– weibliche Sterilität => Samenbildung in der Anlage
– Zur Vermeidung eines vertikalen Transfers wird
beides gebraucht.
• Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative
Erfassung
– Prozentsatz falscher Blüten
Quantitative Ausprägung würde im Ernstfall aber
kritisch zu bewerten sein.
P1 Espe
• Projektplan
– 7 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens
vermittelt) und Kontrolle
– Jeweils zwei Varianten: ohne und mit rolC-Gen
Das rolC-Gen verursacht eine gut erkennbare
Wuchsveränderung.
– Jeweils 2 Varianten: ohne und mit Konstrukt für
Frühblühen
– Je Variante 10 transgene Bäume geplant
rolC- Gen
(A) geringer Wuchs
(B) hellgrüne Blattfarbe
Eigenschaften rolC-transgener Aspen (links, mitte)
im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen (rechts).
P1 Espe
• Versuchsumfang
– (7 +1) * 2 * 2 = 32 Varianten = 320 Bäume
• Kontrolle der transgenen Espen mit PCR
– Einbau nur eines Konstruktes wichtig, da
mehrere Konstrukte sich gegenseitig
beeinflussen könnten
– Ermittlung des Insertionsortes
• Anzucht der Bäume bis zur Blüte
• Beobachtung über mehrere Perioden
Konstrukte
Promotor/ZielgenKombination
Zielgewebe der
Expression
Verfügbarkeit
PTA29-Barnase
Tapetum
Dr. Debener
PTA 29-Vst1
Tapetum
Dr. Debener
ClGPDHC- Barnase
Pollen
Dr. Debener
ClGPDHC-Vst1
Pollen
Dr. Debener
PTA29-argE
Tapetum
Prof. I. Broer
Stigma-spez.
Promotor-Barnase
DefH9-iaaM
Stigma
Dr. Debener
Stigma
Prof. A. Spena
P1 Espe
• Versuchsfragen:
– Zeigen die Konstrukte die gewünschte Wirkung?
– Ist die Wirkung ausreichend?
• Vergleiche:
– Jeweils mit gegen ohne Konstrukt, sowohl mit als
auch ohne rolC-Gen (Einfach- gegen
Doppeltransformation)
– Verschiedene Konstrukte miteinander
P1 Espe – Offene Fragen
• Es ist unbekannt, wann und wie intensiv die
Espen blühen, es besteht aber die Hoffnung,
dass dies in 1-3 Jahren realisierbar ist.
• Es ist unbekannt, ob die Konstrukte zu
ausreichender männlicher oder weiblicher
Sterilität führen.
• Es darf zur Erreichung des Zieles nur ein
kleiner Teil falscher Blüten gebildet werden.
Wer setzt fest , welcher Anteil tolerierbar ist
(etwa 5%) ?
P1 Espe - Sicherheitsaspekte
• Wenn die Espen blühen und der Mechanismus
nicht mit Sicherheit erfolgt, könnte eine
Ausbreitung stattfinden.
• Dem kann im Projekt dadurch vorgebeugt
werden, dass die blühenden Bäume ins
Gewächshaus gebracht werden.
• Nach Ablauf des Versuches wird die Fläche
vollständig gerodet.
P1 Espe – biometrische Aspekte (1)
• Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen
– Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle
verglichen.
– Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen
untereinander.
• Stichprobenumfang
– kein Problem, da viele Blüten vorhanden
• Zeitabhängigkeit
– Effekt unbekannt
– Blüte auch in Folgejahren, aber im Projektzeitraum
wohl nicht mehr verfügbar
P1 Espe – biometrische Aspekte (2)
Quantitative Erfassung der Wirkung
• Idealfall: 100 %, jeder Abweicher
widerlegt die Hypothese
• Realfall: vorgegebene Frequenz an
Abweichern
– Ist die Frequenz genotypabhängig?
– Welche Verteilung liegt vor
(binomial, Poisson, geklumpt) ?
– Wie ist die Frequenz zu bewerten?
P2 Apfel - Ziele
• Übertragung von Resistenzen über Transformation
– Feuerbrand
– Apfelschorf
– Apfelmehltau
• Verhinderung der Auskreuzung transgener Bäume
– männliche Sterilität
– Parthenokarpie
=> kein Pollenflug aus der Anlage
=> samenlose Früchte
• Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative
Erfassung
– Prozentsatz falscher Blüten
P2 Apfel
Projektplan
• 6 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens
vermittelt) und Kontrolle
• Transformation transgener und nicht
transgener Linien der Sorte ‚Pinova‘ in
vitro
• Kontrolle der Transformation
– PCR, Southern Blot, ELISA, ...
• Veredlung auf M9 mit ‚Hibernal‘ als
Zwischenveredlung
P2 Apfel - Konstrukte
Promotor/ZielgenKombination
Zielgewebe der
Expression
Zielstellung
PTA29-Barnase
PTA29-Vst1
CIGPDHC-Barnase
Tapetum
Tapetum
Pollen
Pollensterilität
Pollensterilität
Pollensterilität
CIGPDHC-Vst1
DefH9-iaaM
Nin88-Nin88-antisense
Pollen
Stigma
Pollen
Pollensterilität
Parthenokarpie
Pollensterilität
P2 Apfel – biometrische Aspekte
• Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen
– Alle Konstrukte werden mit derselben
Kontrolle verglichen.
– Zusätzlich interessiert der Vergleich der
Kontrollen untereinander.
– Vergleich transgen gegen nicht transgen
• Andere Aspekte ähnlich wie bei den
Espen (P1)
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Pappel und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
P3 Rosen - Teilprojekt 1
• Auskreuzungsrate bestimmter Rosentypen
– Floribundarosen (‚Heckenzauber‘)
– Teehybriden (‚Pariser Charme‘)
• Erfassung der Polleneintragsrate
über selbstinkompatible Fängerpflanzen (diploider
Genotyp) in Abhängigkeit von
– Abstand: 0, 20 und 200 m
– Richtungen: 2-3
– Standorte: Ahrensburg, Groß Lüsewitz
• Überprüfung der Auskreuzungsrate
– an Samen
– mittels molekularer Marker
P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Versuchsplan)
F
20
200
F PC F
Heck
F
F
F
20
200
F
F
Versuchskern:
5 Pariser Charm
5 Heckenzauber
Mantel: 20 Fängerpflanzen
in 20 bzw. 200 m Entfernung:
je 5 Fängerpflanzen
Merkmale:
Zahl der Früchte zu Zahl der Blüten
Je Fängerblock max. 20 Samen
P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Auswertung)
• Früchte pro Blüte
Heckenzauber und Pariser Charme als Kontrollen
für die selbstinkompatiblen Fängerpflanzen
– Vergleich von Anteilen; 2 Orte
• Samenkeimrate bei Fängerpflanzen
– mehrdimensionale Kontingenztafel
– Orte, Abstände, Richtungen
• Herkunft von Samen bei Fängerpflanzen
– mehrdimensionale Kontingenztafel
– Orte, Abstände, Richtungen sowie Genotypen
(Heckenzauber‚ Pariser Charme, andere Quellen)
P3 Rosen - Teilprojekt 2
• Auskreuzungsrate aus Kulturrosen in Wildrosen
– Quelle: 2 Rosenzuchtbetriebe
– Empfänger: natürlich vorkommende Wildrosen in der
Umgebung
• Versuchsplan
– Anzahl Wildrosen unbekannt, daher kein Plan möglich
– max. 100 Samen pro gefundener Pflanze
– max. 1000 Samen
• Auswertung
– Anteil Samen auf Wildrosen aus Auskreuzung
– Identifizierung über molekulare Marker
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Pappel und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
P4 und P5 Pappeln: Ziele
Projektplan
• Freisetzung transgener Pappeln mit dem Ziel
der Schwermetallaufnahme zur Entgiftung
verseuchter Böden.
Hintergrund ist die Überexpression
cytosolischer -Glutamylcystein-Synthetase
(cyt-ECS) transgener Pappeln.
• Stabilität des Transgens über mehrere Perioden
• Erfassung des horizontalen Gentransfers über
Mykorrhizen
P4 Pappeln
• Versuchsumfang
– 2 Standorte (Mansfelder Land, Ekatarinenburg)
– 3 Belastungsgrade mit Kupfer
– transgene Pappeln und Kontrollen randomisiert in
50*50 m² Parzellen
• Beobachtungszeitraum
– 3 Jahre (geplant), jedes Jahr werden einige Bäume zur
Untersuchung gerodet und ergeben Lücken.
• Vergleiche
– zwischen Kontrollbäumen und transgenen Bäumen
– zwischen Kupferbelastungen
– für jeden Standort getrennt
Mansfelder Land
geringe Kupferbelastung
(
)
mittlere Kupferbelastung
keine Fläche gefunden
hohe Kupferbelastung
P4 Pappeln - Versuchsplan
Ekatarinenburg
P4 Pappeln – Versuchsplan (Detail)
17
25
19
15
11
10
13
8
18
21
35
24
26
1
36
14
3
31
12
6
7
30
2
29
33
28
34
32
9
27
20
16
23
22
5
4
Ausschnitt; schwarz = Kontrolle, rot = transgen
Insgesamt 144 = 72+72 Bäume + 2 Reihen Kontrolle als Mantel
P4 Pappeln – Analyse des
Entgiftungsprozesses (1)
• Zu Beginn des Versuches
– Bodenproben an verschiedenen Stellen
• Während der Vegetation
– 3 Probenahmetermine im Abstand von 2 Monaten
– Messung der Konzentration an Thiolen
(Glutathion und Phytochelatine) in den Blättern
(HPLC)
– Messung der Expression des gshl Gens (Northern
Blot)
P4 Pappeln – Analyse des
Entgiftungsprozesses (2)
• Am Ende der Vegetation jedes Jahr
– Rodung von 10 Kontroll- und 10 transgenen
Bäumen je Parzelle
– Chemische Analyse der Biomasse (in Blätter und
Holzteile getrennt) auf 10 Schwermetalle
– Bodenproben an den Entnahmestellen
– Sammeln der Blätter nach Laubfall (vermeidet
Wiedereintrag)
• Am Ende des Versuches
– Rodung der Flächen
– Verbrennung und Ascheanalyse auf Schwermetalle
– Bodenproben an verschiedenen Stellen
P5 Pappeln und Mykorrhizen
Schwerpunkte sind:
• Untersuchung des Einflusses der verstärkten
Schwefelaufnahme durch transgene Pappeln
auf die Zusammensetzung der für Pappeln
wichtigen Mykorrhizen
• Beeinflussung der Schwefelaufnahme
transgener Pappeln durch Mykorrhiza
• Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer
(Übertragung von Transgenen von der Pappel
auf Mykorrhizen). Hierzu dient der Versuch
zur Bodenentgiftung (P4).
P4 und P5 Pappeln –Mykorrhiza
• Mykorrhizisierungsgrad an Stichproben
(20 +30+30 Bäume)
• Anzucht der gefundenen Mykorrhizen und
deren Bestimmung der Arten
• Verschiedene Entnahmezeitpunkte, um
Umwelteinflüsse zu erfassen
• Da horizontaler Gentransfer ausgesprochen
selten erwartet wird, ist eine biometrische
Analyse kaum möglich.
Gliederung
1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
2. Projektübergreifende Aspekte
3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei
Pappel und Apfel
4. Vertikaler Genfluss bei Rosen
5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei
Pappeln
6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein
P6 Wein – Auswirkung transgener Reben
auf Arthropoden als Nichtzielorganismen
• A: Laborversuche zum Einfluss von Enzymen
und Insektenpathogenen auf Larven von
Lobesia botrana (Traubenwickler, Schädling)
und Typhlodromus pyri (Raubmilbe, Nützling)
• B: Gewächshausversuche mit transgenen
Reben, die diese Enzyme enthalten
• C: Freisetzungsversuche mit transgenen Reben
P6 Wein – Auswirkung transgener Reben
auf Arthropoden als Nichtzielorganismen
• Enzyme
– CHI (Chitinase)
– GLU (1,3 Glucanase)
– RIP (Ribosom-inhibierendes Protein)
• Insektenpathogene
– Bacillus thuringiensis
– Entomopathogene Pilze
• Erfasste Wirkungen
– Direkte Toxizität der Enzyme
– Synergistische und antagonistische Wirkungen der
Enzyme über die Insektenpathogene
P6 Wein – Biometrische Aspekte
• Toxizität über Probitanalyse
– LD50 sowie LD20 und LD80
– Schwellenwerte über Vorversuche
• Mikroskopische Untersuchungen
– Beschaffenheit der Matrix des Mitteldarmes wird
an 10 Larven je Stufe analysiert
• Sequentielle Vorgehensweise
– Das Ergebnis der Laborversuche bestimmt das
Vorgehen im Gewächshaus, dieses wiederum die
Strategie bei den Freilandversuchen
Zusammenfassung
1. Der Verbund ist vergleichsweise heterogen.
2. Die Dauerhaftigkeit der Gehölze verträgt sich
schlecht mit der zeitlich befristeten Projektdauer.
3. Die Möglichkeiten der biometrischen
Versuchsplanung sind bei Freilandversuchen und
z. T. auch im Gewächshaus stark eingeschränkt.
4. Einige Ereignisse werden nur selten erwartet, der
für sichere Aussagen notwendige große
Stichprobenumfang ist aber technisch meistes
nicht machbar.
5. Im Vordergrund steht der Erkenntnisgewinn,
nicht die Sicherheit.

Gehölze