V7 Genexpression - Microarrays
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Idee: analysiere Ko-Expression von mehreren Genen um auf funktionelle
Ähnlichkeiten zu schließen
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wichtige Fragen:
(1) wie wird Genexpression reguliert?
(2) was wird mit MicroArray-Chips gemessen?
(3) wie analysiert man Daten aus MicroArray-Experimenten?
(4) was bedeutet Ko-Expression funktionell?
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Inhalt V7:
(1) Hintergrund zu Transkription und Genregulationsnetzwerken
(2) Micro-Arrays
(3) Übung: analysiere selbst Daten aus einem MicroArray-Experiment
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das Transkriptom
Als Transkriptom kennzeichnet man den Level an transkribierter messenger RNA
(mRNA) für alle Gene des Genoms.
Heutzutage gilt dies sowohl für die Protein-kodierenden Gene als auch für
RNA-kodierende Gene, die nicht in Protein translatiert werden.
An die eigentliche Transkription in pre-mRNA schließen sich noch viele
Prozessierungsschritte zur eigentlichen mRNA an, wie
- die Anheftung eines ca. 250 nt-langen PolyA-Schwanzes,
- evtl. Editing (Austausch von Nukleotidbasen), sowie
- Spleißen.
Heute werden wir uns auf den reinen Prozess der DNA-Transkription
beschränken.
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Transkription durch RNA Polymerase II
Tamkun J. Nat. Gen. 39, 1421 (2007)
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Transkriptions – Gen-Regulationsnetzwerke
Die Maschine, die ein Gen
transkribiert, besteht aus etwa 50
Proteinen, einschließlich der
RNA Polymerase. Dies ist ein
Enzym, das DNA code in RNA
code übersetzt.
Eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren bindet an die DNA
gerade oberhalb der Stelle des
Kern-Promoters, während
assoziierte Aktivatoren an
Enhancer-Regionen weiter
oberhalb der Stelle binden.
http://www.berkeley.edu/news/features/1999/12/09_nogales.html a
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endomesodermales Gen-Regulationsnetzwerk der Seegurke
http://sugp.caltech.edu/endomes
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5
regulatorisches Netwerk von E. coli
RegulonDB: Datenbank mit Information zur transkriptionellen Regulation in
E.coli; 167 Transkriptionsfaktoren steuern Tausende von Genen.
Durch den hierarchischen Aufbau reichen 7 regulatorische Proteine (CRP, FNR,
IHF, FIS, ArcA, NarL and Lrp) aus um die Expression von mehr als der Hälfte
aller E.coli Gene zu modulieren.
Martinez-Antonio, Collado-Vides, Curr Opin Microbiol 6, 482 (2003)
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6
Genregulationsnetzwerk um Oct4
Ein eng verwobenes Netzwerk aus
neun Transkriptionsfaktoren hält
embryonale Stammzellen im
pluripotenten Zustand.
Der Masterregulator Oct4 sowie
Sox2 und Dax1 haben
autoregulatorische
Feed-Forward Feedback-Schleifen.
Kim et al. Cell 132, 1049 (2008)
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7
7
PluriNetwork in Maus
Som et al. Plos ONE 5, e15165 (2010)
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PluriNetwork in Maus
PluriNetWork comparing microarray data from
mouse embryonic fibroblast (MEF) and partially
induced pluripotent cells (piPS).The top 10%
startups (red) and the top 10% shutdowns (green)
are highlighted. Link scores are based on
log-transformed gene expression intensities,
corrected for variance.
Som et al. Plos ONE 5, e15165 (2010)
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integrierte zelluläre Netzwerke
Statt des komplexen zellulären
Netzwerks (links) stellen
Genregulationsnetzwerke nur
die Projektion auf die GenEbene dar (unten).
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10
10
veränderte Genregulation bei Krankheiten etc.
Ausgangspunkt: bestimmte Krankheiten (Krebs ?) entstehen anscheinend durch
die veränderte Expression einer Anzahl von Genen, nicht eines einzelnen Gens.
Wie kann man alle Gene identifizieren, die für diese Veränderung des Phänotyps
verantwortlich sind?
Am besten müsste man z.B. die Expression aller Gene in den Zellen von
gesunden Menschen und von Krebspatienten bestimmen.
Dann möchte man herausfinden, worin die Unterschiede bestehen.
Genau dies ermöglicht die Methode der Microarrays.
Microarrays messen die Expression „aller“ Gene zu einem bestimmten Moment im
Zellzyklus unter bestimmten Umgebungsbedingungen.
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Was mißt man mit Microarrays?
Häufig verwendet werden ZweifarbenMicroAssays:
Sample A: rot
Sample B: grün
Ziel: bestimme das Verhältnis rot/grün
dunkel: Gen weder in A noch B exprimiert
rot: Gen nur in A exprimiert (bzw. viel stärker)
grün: Gen nur in B exprimiert
gelb: Gen in A und in B exprimiert.
Das Licht wird von zwei Farbstoffen (roter Cy5
und grüner Cy3) erzeugt, die an die cDNA
angeheftet wurden (die cDNA wurde „gelabelt“)
und die unter Laserlicht fluoreszieren.
pgrc.ipk-gatersleben.de
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Experimentelles Vorgehen
Isolierung einer Zelle im Zustand X
Extraktion aller RNA
Umwandlung in cDNA
Markierung mit Farbstoff (rot oder grün)
Pipette enthält markiert cDNA aller in der Zelle
exprimierten Gene.
Man bringt nacheinander die cDNA aus zwei
verschiedenen Zellpräparationen auf, die
unterschiedlich (rot/grün) gelabelt wurden.
pgrc.ipk-gatersleben.de
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Experimentelles Vorgehen
Aufbringen des zellulären cDNA-Gemischs
auf die einzelnen Zellen des Arrays.
Jede Zelle enthält an die Oberfläche
funktionalisiert einen cDNA-Klon aus einer
cDNA-Bibliothek.
Jede Zelle misst daher die Expression eines
einzelnen Gens.
pgrc.ipk-gatersleben.de
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Einstellung des Gleichgewichts
Die Gesamtzahl an gebundenen DNA-Strängen zu einer Zeit t sei nc(t).
Dann kann man den erwarteten Mittelwert nc(t) nach dieser Zeit t durch eine
Ratengleichung ausdrücken:
k1* und k-1 : Assoziations- und Dissoziationsraten,
mit der die DNA-Stränge der Probe an den
Microarray binden,
np : Gesamtzahl an immobilisierten DNA-Strängen
auf der Microarray-Oberfläche
nt : Gesamtzahl an DNA-Strängen in der Probe
Hassibi et al., Nucl. Ac. Res. 37, e132 (2009)
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Auslesen der Probe: Laserlicht
Man stimuliert sowohl
die Fluoreszenz bei der
roten als auch bei der
grünen Wellenlänge.
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Auswertung von
Microarray-Experimenten
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Prozessierung der Daten
bevor die Daten auf Ko-Expression untersucht werden können,
müssen sie in verschiedenen Schritten prozessiert werden.
(1) Einlesen der Arrays mit einem Scanner und dann Identifizierung der Signale
der kreisförmigen Zellen mit einem Computerprogramm.
(2) Einlesen der Intensitäten aller Zellen (spots).
(3) Zellen mit einem schlechten Signal-zu-Rausch-Verhältnis werden entfernt.
(4) Die Daten werden logarithmiert, da die Expressionsraten dann oft in etwa
einer Normalverteilung (Glockenkurve) ähneln.
Orengo-Buch
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Expressionsverhältnis
Der relative Expressions-Wert eines Gens kann als Menge an rotem oder
grünen Licht gemessen werden, die nach Anregung ausgestrahlt wird.
Man drückt diese Information meist als Expressionsverhältnis Tk aus:
Für jedes Gen k auf dem Array ist hier Rk der Wert für die Spot-Intensität für die
Test-Probe und Gk ist die Spot-Intensität für die Referenz-Probe.
Man kann entweder absolute Intensitätswerte verwenden, oder solche, die um
den mittleren Hintergrund (Median) korrigiert wurden.
In letzterem Fall lautet das Expressionsverhältnis für einen Spot:
M. Madan Babu, An Introduction
to Microarray Data Analysis
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Transformation des Expressionsverhältnisses
Das Expressionsverhältnis stellt auf intuitive Art die Änderung von
Expressions-Werten dar. Gene, für die sich nichts ändert, erhalten den Wert 1.
Allerdings ist die Darstellung von Hoch- und Runterregulation nicht balanciert.
Wenn ein Gen um den Faktor 4 hochreguliert ist, ergibt sich ein Verhältnis von 4.
R/G = 4G/G = 4
Wenn ein Gen jedoch um den Faktor 4 runterreguliert ist, ist das Verhältnis 0.25.
R/G = R/4R = 1/4.
D.h. Hochregulation wird aufgebläht und nimmt Werte zwischen 1 und Unendlich
an, während Runterregulation komprimiert wird und lediglich Werte zwischen
0 und 1 annimmt.
M. Madan Babu, An Introduction
to Microarray Data Analysis
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Logarithmische Transformation
Eine bessere Methode zur Transformation ist, den Logarithmus zur Basis 2 zu
verwenden.
d.h. log2(Expressionsverhältnis)
Dies hat den großen Vorteil, dass Hochregulation und Runterregulation gleich
behandelt werden und auf ein kontinuierliches Intervall abgebildet werden.
Für ein Expressionsverhältnis von 1 ist log2(1) = 0, das keine Änderung bedeutet.
Für ein Expressionsverhältnis von 4 ist log2(4) = 2,
für ein Expressionsverhältnis von 1/4 ist log2(1/4) = -2.
M. Madan Babu, An Introduction
to Microarray Data Analysis
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Normalisierung von Arrays
Wie alle anderen biologischen Experimente zeigen auch Microarrays zufällige und
systematische Abweichungen.
Zufällige Schwankungen treten auf
- in der absoluten Menge an mRNA, die eingesetzt wird,
- in der Hybridisierungs-Technik und
- in Waschschritten.
Systematische Unterschiede gibt es z.B. bei den physikalischen Fluoreszenzeigenschaften der beiden Farbstoffmoleküle.
Um diese systematischen Abweichungen der Genexpressionslevel zwischen zwei
Proben zu unterdrücken, verwendet man Normalisierungsmethoden.
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Entfernen problematischer Datensätze: NUSE-Test
Man schätzt den unskalierten Standardfehler für
die Expression jedes Gen auf jedem Array ab und
mittelt über alle Arrays und normiert dann über alle
Arrays. Danach sollte der normierte unskalierte
Standardfehler für alle Gene ungefähr 1 sein.
In diesem Beispiel weicht der
NUSE-Wert für GSM9833 und
GSM9836 signifikant von 1 ab.
Daher werden diese Datensätze
als Ausreißer betrachtet und
entfernt.
MSc thesis Siba Ismael
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Normalisierung
Korrigiere die Daten um Hintergrundeffekte (Details werden nicht behandelt).
1. Schritt einer Normalisierung: wähle einen Satz von Genen, für die ein
Expressionsverhältnis von 1 erwartet wird (z.B. House keeping-Gene).
2. Berechne eine Normierungsfaktor aus der beobachteten Variabilität der
Expression für diese Gene.
3. Wende diesen Normierungsfaktor auf die Expressionswerte der anderen
Gene an.
Wichtig: durch diese Normierung werden die Daten verändert.
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Normalisierung
Man nimmt grundsätzlich an, dass die absolute Menge an RNA in beiden
Messungen dieselbe ist und dass die selbe Anzahl an RNA-Molekülen in beiden
Messungen mit dem Microarray hybridisieren.
Dann sollten auch die Hybridisierungsintensitäten der beiden Gen-Mengen
gleich sein.
Berechne Normierungsfaktor
Reskaliere die Intensitäten, so dass
und
D.h. nur die Grünwerte werte skaliert, die Rotwerte bleiben unverändert.
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Normalisierung
Damit wird das normierte Expressionsverhältnis
Dies ist äquivalent zu
Damit wird das Expressionsverhältnis so verschoben, dass das mittlere
logarithmierte Expressionsverhältnis für die Gen-Menge gleich 1 ist.
Es gibt viele andere Normierungsmethoden, bei denen z.B. das mittlere
logarithmierte Expressionsmittel gleich 0 gesetzt wird oder noch andere
Varianten.
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Globale Normalisierung
In der globalen Normalisierungsmethode nimmt man an, dass die Cy5 und Cy3Intensitäten auf einer Platte über einen konstanten Faktor zusammenhängen:
Cy5  k  Cy3
Außerdem benutzt man wiederum, dass sich für die Mehrzahl der Gene der
Expressionslevel zwischen zwei mRNA-Populationen häufig nicht ändert.
Damit folgt
 Cy5 
 Cy5 
  log2 
  log2 k
log2 
 k  Cy3 
 Cy3 
Orengo-Buch
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Normalisierung
Orengo-Buch
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28
Normalisierung: Tukey's median polish
Reihenmedian von jeder Reihe abziehen.
Spaltenmedian von jeder Spalte abziehen.
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Orengo-Buch
29
Normalisierung: Tukey's median polish (II)
Nochmal Reihenmedian von jeder Reihe abziehen.
Nochmal Spaltenmedian von jeder Spalte abziehen.
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Orengo-Buch
30
Normalisierung: Tukey's median polish (II)
Ziehe diese Matrix von der Originalmatrix
ab:
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Orengo-Buch
31
Daten-Interpretation von Expressionsdaten
Annahme:
Funktionell zusammenhängende Gene sind oft ko-exprimiert.
Z.B. sind in den 3 Situationen
X Y
Y X
Z  X, Y
(Transkriptionsfaktor X aktiviert Gen Y)
(Transkriptionsfaktor Y aktiviert Gen X)
(Transkriptionsfaktor Z aktiviert Gene X und Y)
die Gene X und Y ko-exprimiert.
Durch Analyse der Ko-Expression (beide Gene an bzw. beide Gene aus) kann
man also funktionelle Zusammenhänge im zellulären Netzwerk entschlüsseln.
Allerdings nicht die kausalen Zusammenhänge, welches Gen das andere reguliert.
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Hierarchisches Clustering zur Analyse von Ko-Expression
Man unterscheidet beim Clustering zwischen anhäufenden Verfahren
(agglomerative clustering) und teilenden Verfahren (divisive clustering).
Bei den anhäufenden Verfahren, die in der Praxis häufiger eingesetzt werden,
werden schrittweise einzelne Objekte zu Clustern und diese zu größeren Gruppen
zusammengefasst, während bei den teilenden Verfahren größere Gruppen
schrittweise immer feiner unterteilt werden.
Beim Anhäufen der Cluster wird zunächst jedes Objekt als ein eigener Cluster mit
einem Element aufgefasst.
Nun werden in jedem Schritt die jeweils einander nächsten Cluster zu einem
Cluster zusammengefasst.
Das Verfahren kann beendet werden, wenn alle Cluster eine bestimmte Distanz
zueinander überschreiten oder wenn eine genügend kleine Zahl von Clustern
ermittelt worden ist.
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Hierarchisches Clustering
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k-means Clustern
Ein Durchlauf der k-means Clustering Methode erzeugt eine Auftrennung der
Datenpunkte in k Cluster. Gewöhnlich wird der Wert von k vorgegeben.
Zu Beginn wählt der Algorithmus k Datenpunkte als Centroide der k Cluster.
Anschließend wird jeder weitere Datenpunkt dem nächsten Cluster zugeordnet.
Nachdem alle Datenpunkte eingeteilt wurden, wird für jedes Cluster das Centroid als
Schwerpunkt der in ihm enthaltenen Punkte neu berechnet.
Diese Prozedur (Auswahl der Centroide - Datenpunkte zuordnen) wird so lange
wiederholt bis die Mitgliedschaft aller Cluster stabil bleibt.
Dann stoppt der Algorithmus.
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Zusammenfassung
Die Methode der Microarrays erlaubt es, die Expression aller möglichen
kodierenden DNA-Abschnitte eines Genoms experimentell zu testen.
Die Zwei-Farben-Methode ist weit verbreitet um differentielle Expression zu
untersuchen.
Aufgrund der natürlichen biologischen Schwankungen müssen die Rohdaten
prozessiert und normalisiert werden.
Durch Clustering von Experimenten unter verschiedenen Bedingungen erhält
man Gruppen von ko-exprimierten Genen.
Diese haben vermutlich funktionell miteinander zu tun.
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Normalisierung