Biochemisches Praktikum für
Biologen
Institut für Biochemie
Peter Friedhoff
Organisationsstufen in der Zelle
Bestandteile einer E. coli Zelle
Bestandteile einer E. coli Zelle
Proteinaufreinigung


Funktion bekannt – Protein unbekannt
Welches Protein ist für eine bestimmte
Funktion verantwortlich?
Protein bekannt – Funktion unbekannt
Welche Funktion hat ein bestimmtes
Protein?
Aufreinigung von Proteinen
Proteineigenschaften
Verfahren

Stabilität

Zellaufschluß

Löslichkeit

Pufferbedingungen

Ladung

Zentrifugation

Hydrophobizität

Fällung

Größe/Form/Masse

Dialyse

spezifische Interaktionen

Säulenchromatographie
(Affinität)
Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)
Aufreinigungsprotokoll von
Proteinen
Voet Biochemistry 3e Page 142
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Aufreinigung von Rattenleber
Glucokinase
Zentrifugation
Dialyse



Dialysemembran
lässt nur kleine
Moleküle hindurch
(z.B. Mr < 5000)
Makromoleküle
werden
zurückgehalten
Anwendung:
Pufferwechsel
Säulenchromatographie
Substanzen gelöste in
mobiler Phase durchlaufen
eine stationäre Phase.
Wechselwirkung
(Verteilung oder Adsorption)
mit der Matrix bestimmen
die Wanderungsgeschwindigkeit der gelösten
Teilchen.
Ionenaustauschchromatographie

Kationenaustausch
stationäre Phase
Anion
z.B. MonoS
(-CH2SO3-) oder
CM-Cellulose (-COO-)


mobile Phase Kation
Anionenaustausch
stationäre Phase
Kation
z.B. MonoQ
(-CH2N+(CH3)3) oder
DEAE-Sepharose
(-CH2N+H(CH3)2)

mobile Phase Anion
Gelfiltration oder
Größenauschlußchromatographie
Affinitätschromatographie


Protein (mobile Phase)
bindet mit hoher
Affinität und
Selektivität an
immobilisierten
Liganden (stationäre
Phase)
Elution erfolgt z.B. mit
freiem Liganden
(Kompetition)
Affinitätschromatographie
Affinitäts-tag
Matrix
Antigen
Antikörper (immobiliert)
6His (His6-tag)
Ni-NTA
Strep-tag II (Peptid)
Streptactin (StreptavidinDerivat)
Glutathion-S-Transferase
Glutathion-Sepharose
Calmodulin-Bindungs-Peptid
Calmodulin-Affinitätsmatrix
Maltose-Bindungs-Protein
Amylose-Matrix
Glucose-Bindungsprotein


GlucoseBindungsprotein
bindet an
immobilisierte Glucose
Elution durch (freie)
Glucose, die GlucoseBindungsprotein von
der Matrix ablöst
(kompetitive Elution)
Ni-NTA-Affinitätschromatographie


Komplex aus His und Ni2+-NTA
Protein mit HistinAffinitätstag bindet an
immobilisierte Ni2+Ionen
Elution erfolgt durch
Imidazol das mit dem
Protein um die
Bindung an Ni2+-Ionen
konkurriert.
Charakterisierung von Proteinen

Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität)

Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse)

Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur)

Massenspektrometrie (Masse/Sequenz)

Edman-Sequenzierung (Sequenz)

Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)
SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE)
SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE)
Schematische Darstellung einer ProteinAufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE
Isoelektrische Fokussierung/
2-D Gelelektrophorese
2-D Gelelektrophorese
Western-Blotting
Voet Biochemistry 3e Page 148
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Western-Blotting
Voet Biochemistry 3e Page 172
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Ionisierungsverfahren für
Massenspektrometrie
Massenspektrometrie
exakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen
Identifizierung von Proteinen mit Hilfe
der Massenspektrometrie

SDS-Gel oder 2D-Gel

Bande/Spot ausschneiden

Tryptischer Verdau der Proteine

Bestimmung der Peptidmassen
 Peptid-Fingerabdruck
 Datenbanksuche nach Proteinen mit
identischem Peptid-Fingerabdruck
Protein-Sequenzierung
Edman-Abbau
Affinitätschromatographie/
Elektrophorese
Ziel des Versuchs




Aufreinigung eines rekombinantes
Proteins exprimiert in Escherichia coli
über Affinitätschromatographie
Verfolgung der Aufreinigung mittels
Fluoreszenz
Analyse der Aufreinigung mittels SDSGelelektrophorese
Untersuchung zur Thermostabilität des
Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im
nativen Zustand
Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)
Die biolumineszierende
Qualle Aequorea victoria
produziert Licht, wenn
Energie des Ca2+aktivierten Photoproteins
Aequorin auf das
Grün-fluoreszierende
Protein (GFP)
übertragen wird
GFP-Chromophor


Chromophor entsteht
nach oxidativer
Zyklisierung des
Tripeptids Ser-Tyr-Gly
Der GFP-Chromophor
fluoresziert nur, wenn
es im nativ gefalteten
Protein vorliegt
Voet Biochemistry 3e Page 119
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
In vivo Fluoreszenz mittels GFP

Grün-fluoreszierende Protein