Experimentelle Methoden zur Bestimmung von
Protein-Protein Wechselwirkungen
Presented by
Stefan Nickels
([email protected])
Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04
Übersicht

Einführung

3 Arten von experimentellen Methoden


Physikalische Methoden

Library basierte Methoden

Genetische Methoden
3 ausgewählte experimentelle Methoden

FRET

NMR chemical shifts

NMR-based protein docking

Referenzen

Diskussion
2
Was will man bestimmen?

Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirken


durch meist transiente aber auch persistente Bindung
Bindungskonstante Ki

Thermodynamische Gleichgewichtsgröße

Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein gebunden

Je kleiner Ki desto stärker Protein-Ligand Bindung

Freie Bindungsenthalpie ∆G
3
Physikalische Methoden I

Methodik


Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von physikochemischen Eigenschaften der Wechselwirkungspartner
Beispiele

Protein Affinity Chromatography

Affinity Blotting

Imunnoprecipitation

Cross-Linking
4
Physikalische Methoden II

Affinitätschromatographie


Um bindende Liganden zu finden
Immobilisierung des Proteins in
der Säule auf einer Matrix






z.B. mittels GST Fusionsproteine
Proteine werden mit Gluthation
S-Transferase markiert
Dieses bindet an GluthationAgarose-Matrix
Zugabe des Ligandengemischs
Bindende werden zurückgehalten,
nicht bindende fließen durch
Komplexe können ausgewaschen
werden
5
Library basierte Methoden I

Methodik



Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in
Gen-Expressions-Bibliotheken
Vorteile

Schnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden

Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar
Nachteil


Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden
Beispiele

Protein Probing

Phage Display

Two-Hybrid Sytem
6
Library basierte Methoden II

Two Hybrid System

Modularer Aufbau von
Transkriptionsfaktoren

DNA-binding domain

Activation domain



Erstellen von sog. Hybriden

Protein X + DNA-binding domain

Protein Y + Activation domain
Wechselwirkung von X und Y


Nicht kovalente WW hinreichend für
Funktion
Domänen bilden funktionellen
Aktivator für Reportergen
=> Expression
Screening von Activator domain
markierten Transkripten einer
cDNA-Library
7
Genetische Methoden I

Methodik

Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt

Sondern WW zwischen Genen werden betrachtet



In vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte
Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WW
zu bestätigen
Beispiele

Extragenic Suppressors

Synthetic Lethal Effects

Overproduction Phenotypes

Unlinked Noncomplementation
8
Genetische Methoden II

Extragenic Suppressors



Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen hervorgerufene
phenotypische Defekte aus
Beobachtung:
Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit
Genprodukten der mutierten Gene wechselwirken
Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Genprodukten
durch z.B.:

Kontrolle der Zellzyklen
9
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy I


Zielsetzung

Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å

Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivo

Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden
FRET

“molecular ruler”

Bestimmung von Distanzen zwischen Molekülen

Viele verschiedene FRET-Methoden

Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen im
lichtmikroskopisch detektierbaren Bereich

Detektion Normalerweise spektroskopisch

Hier lichtmikroskopisch
10
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy II

Funktionsprinzip





Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei
bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen
Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wellenlänge
angeregt, so fluoresziert er
In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, überträgt der
Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor
Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz des
Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching)
Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Löschung der
Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werden
11
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy III


Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der
beiden Fluorophore
R0 ist der sog. Förster-Radius




spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 Å
Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und
Akzeptoranregungsspektrum
kein FRET bei Abständen > 2R0
Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der DonorEmissions-Löschung


IDA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors
IDA†= Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von photogebleichtem A.
12
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IV

Experiment

Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran

Fluorophor-Paar


R0 = 53 Å
Donor Cy3
Akzeptor Cy5
Absorptionsmaximum
550 nm
650 nm
Emissionsmaximum
570 nm
670 nm
Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Markierung
Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Nucleotidase
aus der Leber von Ratten

Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markierten
IgG-AntiKörpern
13
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy V

Aufnahme von 4 Bildern

Cy3-Emission vor dem Bleichen



Cy5-Emission vor dem Bleichen



Kein FRET mehr
Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile)
Cy5-Emission nach dem Bleichen


Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung mit
Cy3 stattgefunden hat
Cy3-Emission nach dem Bleichen


Auftreten des FRET
Wenig Donor Fluoreszenz
Keine Emission wegen vollständiger
Ausbleichung
Datenanalyse


Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:
Berechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes
a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte
14
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VI

Auswertung




Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen 0
und 40%
lassen hier nicht auf spezifische WW
zwischen den Nucleotidasen schliessen
Effizienz hängt ab von der
Oberflächendichte der Proteine in der
Membran (Zufällige Nähe)
Fazit


Transfer Effizienz reflektiert nicht
unbedingt eine spezifische WW
E abhängig von vielen Parametern:




Größe des gelabelten Proteins
Sättigung des Antigens mit Antikörper
Orientierung der Fluorophore
Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können
spezifische WW unterschieden werden


Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung
Gesamtkonzentration von markierten Molekülen
15
NMR chemical shift mapping I

Zielsetzung


Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Proteinen
mittels zweidimensionaler (1H, 15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie
Grundlagen der H-NMR Spektroskopie




Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen
Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel zum
Magnetfeld
Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie
=> NMR-Signal
Identifizierung aller Protonen in einem Molekül
oder ein Komplex aus Molekülen
16
NMR chemical shift mapping II

Die chemische Verschiebung

Abschirmung




Entschirmung




Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld
=> Abschirmungseffekt
Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen
Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch
z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)
diese ziehen die Elektronen zu sich
Niedrigere Feldstärke benötigt
Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch
Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan)


Alle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung
=> nur ein Signal
Alle Protonen maximal abgeschirmt
17
NMR chemical shift mapping III

Die J-Kopplung

Spin-Spin Kopplung





Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Magnetfeldstärke
Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, ↑ oder ↓
=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds
Da beide Zustände gleichwahrscheinlich
=> Aufspaltung des Signals in Multipletts
1 benachbartes Proton => 2 Signale
2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten
usw.
Kopplungskonstante J




Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J
Je nach Wert: Abschätzung
wie viele Bindungen
voneinander entfernt
2 Bindungen, geminal, 2J
3 Bindungen, vicinal, 3J
18
NMR chemical shift mapping IV

(1H,
15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie

HSQC = Heteronuclear single quantum coherence

2D-NMR



Heteronuclear Single quantum:



Bestimmung der 1J Kopplung zwischen H und N
=> direkt verbundene Atome
Kreuzpunkte: Kopplung von H und N
Untersuchung von Proteinen



x-Achse: Verschiebung von H
y-Achse: Verschiebung von N
Jede Aminosäure außer Prolin:
Kopplungssignal der Amidgruppe
Ebenso AS-Ketten wegen Peptidbindung
WW zwischen Proteinen


Bindung von Ligand an 15N markiertes Protein
=> Änderung der chem. Verschiebungen
Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei
zugewiesenem Spektrum
19
NMR chemical shift mapping VI

Experiment

Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS)



Bekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies

Betrachtung von B. subtilis und E. coli




Teilreaktion:
Übertragung von Phosphor
große Ähnlichkeit in 3D Struktur
Homologe WW
stark:
bsHPR + bsEIIAglc
Heterologe WW
stark:
ecHPR + bsEIIAglc
schwach: bsHPR + ecEIIAglc
ecHPR + ecEIIAglc
Fragestellung:

Kann „NMR chemical shift mapping“
Spezifität der Reaktionen
widerspiegeln?
20
NMR chemical shift mapping VII

Versuchsdurchführung

Untersuchung von nicht
phosphorylierten Proteinen um




Mögliche Rückreaktion
auszuschließen
Phosphohydrolysis
auszuschließen
Phosphorylierung hat keine
relevanten Auswirkungen auf
WW
4 NMR-Experimente

NMR-Spektren von 15N-HPR vor
(blau) und nach Zugabe (rot)
von unmarkiertem EIIAglc

A: ecHPR + ecEIIAglc

B: bsHPR + bsEIIAglc

C: ecHPR + bsEIIAglc

D: bsHPR + ecEIIAglc
21
NMR chemical shift mapping VIII

Auswertung



Keine Verschiebung
bei bsHPR + ecEIIAglc (D)
=> Überlagerung der Kreuzpunkte
=> keine WW
Durch Zuordnung der Spektren
=> Identifizierung von ähnlichen
Bindungstellen (schwarz)
Fazit


Methode geeignet um spezifische WW zu detektieren
Trotz hoher Konzentrationen (>200 μm) von gereinigtem Protein bei
NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WW
22
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm I

Idee

Protein-Protein Docking Problem




Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 1H-NMR-Spektrum
als Input
Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997)



Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B
Ermittle 3D-Struktur des Komplexes AB
Generiert Liste möglicher Komplexe
Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion
Ziel

Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des
experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht
23
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm II

Neue Scoring Funktion


Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex
Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum
=> Bewertung der Komplexe

Berechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes

Zerlegt Chemische Verschiebung δ in 4 Teile:

δRC: Random Coil shift

δA: Magnetic Anisotropy

δJB: Ring current, Ringstromeffekt

δEF: Electric field effect
24
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm III

δJB - Electric field effect

Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Elektronen

Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-H

Konstante ε übernommen von Williamson und Asakura(1993)

Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb


Atomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld
(Connell et al. 1995)
δRC – Random coil shifts


Verschiebungen von
nicht definiert gefalteten
As-Ketten
Übernommen aus
der BRMB Datenbank
25
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm IV

δA – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung

Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen die gleiche
Elektronenverteilung

Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene

Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix)

Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung




R: Abstand Proton-Anistropische Bindung
Na: Avogadrosche Zahl
θi: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R
Χi: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung
26
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm V

δJB – Ringstromeffekt


Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen ungleiche
Elektronenverteilung durch π-Elektronen-System
Oberhalb der Ringebene stärker
abgeschirmt als in der Ebene



Äußeres Magnetfeld erzeugt
Ringstrom im Aromaten
Erzeugt seinerseits entgegen
gesetztes Magnetfeld
Modelliert nach Johnson and Bovey (1958):






n = Anzahl der π-Elektronen
e0, m = elektrische Ladung und Masse
e = Lichtgeschwindigkeit
a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39Å)
p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder
K,E = komplett elliptische Integrale
27
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm VI

Bestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums


Simulation mittels Lorentzschen Linien
Gesamtspektrum = Linearkombination der
Lorentzlinien





W = Linienbreite
( 0.0032 ppm2 )
Pi = Peakposition
Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger
Lösung vorhanden
Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (Sexp) und simuliertem
Spektrum (Sepx) an 5000 verteilten Positionen xi im Bereich (-2 bis +12 ppm)
Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet
28
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm VII

Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen



Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue
Scoring-Funktion
Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte
Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten
Evaluierung

4 Komplexe




Calmodulin + Ca2+ abhängige Proteinkinase
Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe
S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein
Homodimere Untereinheiten von S100B(ββ)

Einzelstrukturen aus PDB

Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Datenbank
29
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm VIII

Auswertung




Auftragung der
möglichen Komplexe
x-Achse: RMSD
y-Achse: Atom-Kontakt
Energie
S100
dimer
Cal +
Pump
Beste Ergebnisse linke
untere Ecke
Beste Ergebnisse ohne
Anisotropieshift
=> herausgenommen,
lokaler Effekt
S100 +
p53
Cal +
Kinase
30
Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based
protein docking algorithm IX

Auswertung

Calmodulin + Ca2+ abhängige Proteinkinase




Gutes Ergebnis
verwunderlich, da mit herkömmlichen
Scoring-Funktion nicht zu docken
Untereinheiten von S100B(ββ)


Gutes Ergebnis
Allerdings falsche Struktur auf Platz 1
Grund unbekannt
S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein


S100 +
p53
Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe


Sehr gutes Ergebnis
Gute Trennung zwischen zwischen True und False Positives
Fazit

Evaluation mit mehr Strukturen benötigt

Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Spektrum

Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche mehr
strukturelle Informationen enthalten
31
Fazit



Experimentelle Methoden oft sehr spezifisch

dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen

unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen Methoden
Nachteile:

Erfordern hohes Fachwissen

Fehleranfällig

Stark abhängig von experimentellen Bedingungen

Zeit- und Kostenintensiv
Ausblick:

Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen
Methoden bringt Vorteil
32
Referenzen

Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, 94-123.


Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, 289-296.


Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Energy
Transfer Microscopy.
Rajagopal, P., Waygood, E.B., Reizer, J., Saier-Jr., M.H., and Klevit,
R.E., (1997) Protein Science, 6, 2624-2627.


Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis.
Demonstration of Protein-Protein Interaction Specificity by NMR Chemical
Shift Mapping.
Kohlbacher, O., Burchardt, A., Moll, A., Hildebrandt, A., Bayer, P.,
and Lenhof, H.-P., (2001) J. Biol. NMR, 20, 15-21.

Structure Prediction of Protein Complexes by a NMR-based Protein Docking
Algorithm.
33
Ende

Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit

Fragen, Fragen, Fragen ? ? ?
34

Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein